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2016, 33(1):7-12.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2016.15284

氧化应激在高碘高氟致甲状腺损伤中的作用


1. 天津市疾病预防控制中心环境健康所, 天津 300011 ;
2. 天津医科大学公共卫生学院, 天津 300070

收稿日期: 2015-04-13;  发布日期: 2017-03-14

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81372934);天津市卫计委攻关项目(编号:14KG120);天津市卫计委面上项目(编号:2014KY20)

通信作者: 刘洪亮, Email: hongliang_liu@sina.com  

作者简介: 崔玉山(1985-), 男, 硕士, 医师; 研究方向:环境与健康; E-mail:

[目的] 探讨氧化应激在高碘和(或)高氟致甲状腺损伤中的作用。

[方法] 建立50 mmol/L KI(高碘)、1 mmol/L NaF(高氟)、50 mmol/L KI+1 mmol/L NaF(高碘高氟)暴露的甲状腺细胞模型和含1.685 mg/L KIO3自来水(高碘)、含20 mg/L NaF自来水(高氟)、含1.685 mg/L KIO3+20 mg/L NaF自来水(高碘高氟)暴露的Wistar大鼠模型并开展人群流行病学调查,采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、分光光度法、电极法、比色法、放射法等检测细胞活性、活性氧(ROS)水平,大鼠尿碘、尿氟、血液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,人血清ROS及三碘甲状腺素(T3)、甲状腺素(T4)和促甲状腺激素(TSH)水平。

[结果] 对照组细胞的活力为(100.00±0.00)%,而高碘、高氟及高碘高氟组下降为(73.54±8.37)%、(84.54±7.55)%和(72.62±7.15)%(P < 0.05),且高碘和(或)高氟组均可改变细胞形态;相对于对照组细胞的ROS荧光度(1 409.50±208.46),高氟及高碘高氟组的ROS荧光度上升,分别为2 304.15±390.47和2 669.24±646.80(P < 0.05)。高碘及高碘高氟联合均明显升高大鼠尿碘水平(P < 0.05);高氟及高碘高氟联合明显升高大鼠尿氟水平(P < 0.05);高碘和(或)高氟可改变大鼠甲状腺滤泡形状;雄性对照组大鼠MDA水平为(3.00±0.33)μmol/L,高氟组大鼠MDA水平上升为(4.27±0.82)μmol/L(P < 0.05),同时雄性对照组大鼠SOD水平为(300.92±36.02)×103 U/L,而高氟组下降为(226.33±41.21)×103 U/L(P < 0.05)。儿童高碘高氟组T4浓度明显上升(P < 0.05);高氟及高碘高氟组儿童血清ROS水平由对照组的(72.83±13.70)×103 IU/L上升为(76.65±125.45)×103 IU/L及(89.95±63.85)×103 IU/L(P < 0.05)。

[结论] 高碘和(或)高氟可造成甲状腺损伤,未发现高碘可致机体氧化应激,但氧化应激参与了高氟及高碘高氟致甲状腺损伤的过程。

关键词: 甲状腺;  高碘;  高氟;  氧化应激 

碘和氟是人体必需的微量元素,均对人体健康呈“U”型效应,即摄入量过低或过高均可对健康造成损伤。饮水是机体摄入碘、氟的重要途径,而中国许多地区如环渤海地区、天津大港等水源中存在高氟高碘并存的现象,大量人群暴露于此环境[1-2]

本课题组前期研究已证实高碘和(或)高氟可造成甲状腺细胞凋亡[3],其他学者通过动物实验也证实高碘和(或)高氟可影响甲状腺结构,干扰甲状腺激素的分泌[4-6],但是高碘和(或)高氟对甲状腺的损伤作用机制尚不清楚。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡,可致大量氧化中间产物增加,诱导多种途径激活,致器官组织损伤[7]。本研究拟检测不同浓度高碘和(或)高氟暴露的甲状腺细胞(Nthy-ori 3-1)、Wistar大鼠和人群的氧化应激指标,从体外、体内和人群流行病学调查三方面研究氧化应激在高碘和(或)高氟致甲状腺损伤中的作用。

1   材料与方法

1.1   体外实验

1.1.1   实验试剂和仪器

RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司,噻唑蓝(MTT)购自美国Biomol公司,活性氧(ROS)试剂盒购自中国碧云天生物技术公司,氟化钠(NaF)购自中国医药集团上海化学试剂公司,碘化钾(KI)购自中国医药集团化学试剂有限公司。所有化学试剂至少为分析纯。

Model 680型酶标仪购自美国Bio Rad公司,倒置显微镜购自日本Olympus公司,LSRⅡ型FACS流式细胞仪购自美国BeetonDiekinson公司。

1.1.2   细胞培养及染毒

永生化人正常甲状腺细胞系(Nthy-ori 3-1)购自英国HPACC(Health Protection Agency Culture Collection)细胞中心。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。细胞分为4组,分别暴露于不同浓度的高碘和(或)高氟:对照组(四蒸水)、高碘组(50 mmol/L KI)、高氟组(1 mmol/L NaF)、高碘高氟组(50 mmol/L KI + 1 mmol/L NaF)。

1.1.3   MTT法检测细胞活力

细胞染毒24 h后,将旧培养液吸出,磷酸盐缓冲剂(PBS)洗涤两次后,每孔加入新培养液0.2 mL和5 mg/mL的MTT溶液20 μL,继续培养4 h后终止培养。弃去上清,每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)后振荡10 min。置于酶标仪上测定光密度(optical density,D)值,检测波长为490 nm。以正常细胞的D值为基准,按下式计算出细胞活力。细胞活力(%)=(D实验-D空白)/(D对照-D空白)×100%。

1.1.4   细胞形态的观察

细胞染毒24 h后,光镜观察细胞形态的变化。

1.1.5   Nthy-ori 3-1细胞ROS的检测

染毒24 h后按照试剂盒说明书,收集细胞及上清液于离心管,800×g离心10 min后弃上清,PBS洗涤细胞后弃上清,将细胞重悬于250 μL荧光探针二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)稀释液(10 μmol/L)中,37℃温箱内避光孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用PBS洗涤细胞3次,以充分去除残留探针。流式细胞仪检测荧光强度(激发波长488 nm,发射波长525 nm),并分析ROS水平。

1.2   体内实验

1.2.1   实验试剂

NaF购自中国医药集团上海化学试剂公司,碘酸钾(KIO3)购自中国医药集团上海化学试剂公司,丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自碧云天生物技术公司。NaF为优级纯,其余化学试剂为分析纯。

1.2.2   动物饲养及处理

选取断乳后1个月,体重为约100 g的Wistar大鼠,雌雄各半,按体重、性别将动物随机分为4组,每组10只,雌雄各半。于染毒4个月后处死。根据预实验结果,分组及处理情况如下:对照组,自来水(F- 0.344 mg/L,I-未检出);高碘组,含KIO3 1.685 mg/L的自来水;高氟组,含NaF 20 mg/L的自来水;高碘高氟组,含KIO3 1.685 mg/L + NaF 20 mg/L的自来水。食物为正常食物。

1.2.3   尿碘尿氟的检测

在处死动物前的一周,分别将每组大鼠置于代谢笼内,收集任意一次尿液,测定尿碘、尿氟含量。尿碘测定采用过硫酸胺消化砷铈催化分光光度法[8],尿氟采用氟离子选择电极法[9]

1.2.4   甲状腺组织形态学观察

取整个甲状腺组织,纵向切开,置于10%中性福尔马林中固定,常规石蜡包埋,5 μm厚连续切片,常规苏木精-伊红(HE)染色,采用BX53显微镜(日本,奥林巴斯)镜下观察。

1.2.5   血浆氧化应激指标的检测

取动物血液置于抗凝管,离心后取血浆,-80℃储存待用,测量时按照试剂盒说明书检测血浆MDA和SOD。

1.3   人群调查

1.3.1   研究对象的选择

根据历史和新测水氟、水碘含量,在天津市不同地区的小学三、四年级学生中调查当地出生和成长的8~10周岁的儿童,排除患有躯体疾病和广泛性发育障碍、精神发育迟滞、情绪障碍及精神病等疾病的儿童后,按照知情同意的原则选取所有研究对象,武清区(对照区)43名,静海县(高氟组)34名(A小学15名,B小学19名),静海县(高碘高氟)21名,共计98名儿童。

1.3.2   水碘、水氟的检测

采用砷-铈接触比色法检测饮水碘质量浓度,采用离子选择电极法检测氟质量浓度。饮用水采集:在每乡镇的取水点或水厂、学校水房或教室采集饮用水样品500 mL。

1.3.3   血清甲状腺激素指标

采集学生血样,放射法[10]检测血清中三碘甲状腺素(T3)、甲状腺素(T4)和促甲状腺激素(TSH)水平。

1.3.4   血浆ROS的检测

采集被调查者空腹血4 mL,离心15 min,收集上清,分装,-80℃低温冰箱保存,一周内检测。按照人ROS酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(美国RapidBio公司)说明书操作检测血浆中ROS水平。

1.4   数据分析

采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。正态分布的资料用均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析,组间两两比较采用SNK检验;非正态资料用中位数±四分位数间距(M±IQ)表示,采用秩和检验进行分析。检验水准为α=0.05。

2   结果

2.1   体外实验

2.1.1   Nthy-ori 3-1细胞形态的变化

对照组细胞呈不规则形,细胞饱满,但是高碘、高氟及高碘高氟组细胞体积变小,形态变圆,贴壁细胞明显减少。见图 1

图 1

各组Nthy-ori 3-1细胞形态(×200)

Figure1.The morphology of Nthy-ori 3-1 cells in each group

[注(Note)]A:对照(Control);B:50 mmol/L KI;C:1 mmol/L NaF;D:50 mmol/L KI + 1 mmol/L NaF。

2.1.2   Nthy-ori 3-1细胞活力和ROS水平

表 1显示,与对照组相比,高碘、高氟及高碘高氟组细胞活力明显下降(P < 0.05);与高氟组相比,高碘高氟组细胞活力下降(P < 0.05)。与对照组相比,高氟及高碘高氟组ROS水平明显上升(P < 0.05);但高碘组与对照组差异无统计学意义(P > 0.05)。

表1

各组Nthy-ori3-1细胞活力和ROS水平(n=3,x±s

Table1.The viabilities and ROS levels of Nthy-ori3-1 cells in each group

2.2   体内实验

2.2.1   大鼠甲状腺结构的变化

对照组大鼠甲状腺滤泡腔呈较均匀的中等大小,滤泡腔内胶质丰富,清晰均匀;高碘组甲状腺既有部分滤泡明显增大,又有部分滤泡变小,且滤泡出现多形性变化;高氟组及高碘高氟组大鼠甲状腺滤泡主要表现为变小,胶质减少,无滤泡腔细胞团明显增多。见图 2

图 2

高碘和(或)高氟暴露4个月后大鼠甲状腺滤泡改变(HE,×200)

Figure2.The thyroid follicles of rats after 4-month exposure to high iodide and/or high fluoride

2.2.2   大鼠尿碘、尿氟的质量浓度

高碘组、高碘高氟组的雄性、雌性大鼠尿碘水平均明显高于对照组(P < 0.05);高氟组、高碘高氟组的雄性、雌性大鼠尿氟水平高于对照组(P < 0.05)。高碘高氟组雄性大鼠尿碘水平低于高碘组(P < 0.05),但雌性大鼠尿碘水平均高于高碘组(P < 0.05);高碘高氟组雌性大鼠尿氟水平低于高氟组(P < 0.05)。见表 2

表2

各组大鼠尿碘、尿氟质量浓度(n=5,x±s

Table2.The levels of urinary iodine and fluorine of rats in different groups

2.2.3   大鼠血浆MDA和SOD水平

与对照组相比,高氟组雄性大鼠SOD水平明显下降(P < 0.05),MDA水平明显上升(P < 0.05)。高碘高氟组雄性大鼠SOD水平高于高氟组(P < 0.05),MDA水平低于高氟组(P < 0.05);高碘高氟组雌性大鼠MDA水平低于对照、高碘和高氟组(P < 0.05)。高碘组SOD和MDA水平与对照组差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 3

表3

各组大鼠血浆SOD和MDA水平(n=10,x±s

Table3.The plasma SOD and MDA levels of rats in different groups

2.3   人群流行病学调查

2.3.1   不同地区水氟和水碘质量浓度

经测定发现被调查地区水氟和水碘质量浓度如表 4所示,高氟地区水氟水平明显高于国家GB 5749—2006中农村小型集中式供水和分散式供水的氟限值(1.2 mg/L),水碘值低于国家GB/T 19380—2003中高碘地区标准值(150 μg/L),高碘高氟地区水碘、水氟水平均高于国家标准值。

表4

不同地区水碘和水氟质量浓度(n=1)

Table4.The water iodine and fluorine levels in different areas

2.3.2   不同地区儿童甲状腺功能指标和ROS水平

三地区儿童T3和TSH水平差异无统计学意义(P > 0.05);高碘高氟区儿童T4浓度高于对照区和高氟区(P < 0.05)。高氟区和高碘高氟区ROS水平高于对照区(P < 0.05)。见表 5

表5

不同地区儿童血清T3、T4、TSH和ROS水平

Table5.The serum T3, T4, TSH and ROS levels of children in different areas

3   讨论

高碘和(或)高氟均是损害人体健康的危险因素,甲状腺是机体内储存碘、氟的主要器官,因此甲状腺可能为高碘和(或)高氟的靶器官。本研究细胞实验发现高碘和(或)高氟可降低细胞相对活力,且改变细胞形态,降低细胞数量;动物实验可见高碘和(或)高氟可改变甲状腺滤泡形状,影响甲状腺结构;人群流行病学调查发现高碘高氟联合可干扰甲状腺激素水平,影响甲状腺功能,因此本研究从体外、体内和人群三方面体现高碘和(或)高氟可对甲状腺的结构和功能造成的影响。

另外,体内实验时,高氟组雄性大鼠SOD、MDA水平与对照组存在差异,而雌性大鼠未出现差异,可能是因为雄性大鼠对氟更加敏感,这与梁妍[11]报道的高氟区男性患氟骨症危险性是女性的2.751倍相符合。另外,雄性高碘高氟组大鼠的尿碘水平低于高碘组,而雌性则高于高碘组,这种差异可能是不同性别大鼠对氟、碘的敏感性不同导致的。染毒结束后高氟组出现SOD下降而MDA上升的现象,SOD的下降和MDA的上升是反映机体抗氧化能力下降、发生氧化应激的指标,因此本结果说明高氟能明显诱导大鼠发生氧化应激。高碘高氟区儿童TSH未见变化,但是T4升高,说明高碘高氟区儿童有甲亢的趋势,但还需其他指标,如抗甲状腺过氧化物酶抗体的佐证。

已知氧化应激可诱导细胞凋亡、造成细胞损伤,损害靶器官[12]。因此本研究探索氧化应激是否在高碘和(或)高氟致甲状腺损伤过程中发挥作用。碘参与甲状腺内自由基的产生及清除过程,可影响甲状腺的抗氧化能力,碘还是甲状腺激素合成的必需元素,可通过甲状腺激素影响其他组织器官的抗氧化能力[13],但研究发现碘对各种细胞的氧化应激的影响存在较大差异:Vitale等[14]发现高碘可以诱导TAD细胞(一种幼儿甲状腺细胞)的ROS水平增高,但Di Matola等[15]研究胺碘酮(能释放大量碘离子)对TAD-2细胞毒性时发现,在引起细胞凋亡情况下碘并没有引起ROS水平的升高。乔潇等[13]也发现碘缺乏可明显诱导机体发生氧化应激,但未发现高碘对甲状腺和血液系统的氧化应激诱导作用。叶振坤等[16]也发现,高剂量碘会使大鼠甲状腺抗氧化酶活性降低,但未出现过氧化损伤。Smyth[17]则认为高碘通过升高ROS诱导细胞凋亡,是因为硒离子的缺少致抗氧化酶功能减少,并不是因为高碘具有诱导氧化应激作用,相反碘离子具有抗氧化功能,Shrivastava等[18]则发现高碘能够明显降低乳腺癌细胞(MCF-7)的存活率,同时也明显降低了乳腺癌细胞的ROS水平。本研究体外和体内实验均发现高碘可损伤甲状腺,但未发现高碘对氧化应激具有诱导作用,与乔潇等[13]研究结果一致,原因可能为机体对高碘具有很强的耐受性。

高氟的氧化应激诱导能力是高氟损伤靶器官的机制之一,其可诱导人胚胎肝细胞,鼠海马神经细胞,乳猪的肝、肾、血液等发生氧化应激[19-21],也可诱导甲状腺发生氧化应激[21]。本研究从体外、体内和人群调查发现高氟可诱导甲状腺和机体发生氧化应激。目前国内外对高碘高氟联合对甲状腺影响的研究较少,本研究发现高碘高氟联合可诱导甲状腺细胞和机体发生氧化应激,说明氧化应激可能参与了高氟高碘致甲状腺损伤的过程。

综上所述,高碘和(或)高氟可对甲状腺造成损伤,高碘造成的损伤可能与氧化应激无关,但氧化应激参与了高氟或高碘高氟联合致甲状腺损伤的过程。

图 1

各组Nthy-ori 3-1细胞形态(×200)

Figure 1 The morphology of Nthy-ori 3-1 cells in each group

[注(Note)]A:对照(Control);B:50 mmol/L KI;C:1 mmol/L NaF;D:50 mmol/L KI + 1 mmol/L NaF。
表1

各组Nthy-ori3-1细胞活力和ROS水平(n=3,x±s

Table 1 The viabilities and ROS levels of Nthy-ori3-1 cells in each group

图 2

高碘和(或)高氟暴露4个月后大鼠甲状腺滤泡改变(HE,×200)

Figure 2 The thyroid follicles of rats after 4-month exposure to high iodide and/or high fluoride

表2

各组大鼠尿碘、尿氟质量浓度(n=5,x±s

Table 2 The levels of urinary iodine and fluorine of rats in different groups

表3

各组大鼠血浆SOD和MDA水平(n=10,x±s

Table 3 The plasma SOD and MDA levels of rats in different groups

表4

不同地区水碘和水氟质量浓度(n=1)

Table 4 The water iodine and fluorine levels in different areas

表5

不同地区儿童血清T3、T4、TSH和ROS水平

Table 5 The serum T3, T4, TSH and ROS levels of children in different areas

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81372934);天津市卫计委攻关项目(编号:14KG120);天津市卫计委面上项目(编号:2014KY20)

[作者简介]

[收稿日期] 2015-04-13

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