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2018, 35(3):241-245.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17466

PCB153对人肾上皮细胞中LINE-1表达及转座的影响


天津医科大学基础医学院, 天津 300070

收稿日期: 2017-07-19;  录用日期:2017-01-11;  发布日期: 2018-05-21

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:21647008);天津市科技支撑计划(编号:16YFZCSY00900);国家重点研发计划(编号:SQ2017YFSF080109)

通信作者: 李光, Email: lig@tmu.edu.cn  

作者简介: 李佳慈(1993-), 女, 硕士生; 研究方向:环境与健康; E-mail:

[目的] 探究2,2',4,4',5,5'-六氯联苯(PCB153)对人肾上皮细胞系(293T)细胞中长散在重复序列-1(LINE-1)基因表达和转座的影响。

[方法] 293T细胞每2 d传代一次,传代后立即使用5 μmol/L PCB153进行染毒。染毒后的细胞置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中继续培养,连续染毒10 d。同时设置二甲基亚砜(DMSO)对照组。采用实时荧光定量PCR技术检测LINE-1开放阅读框1(ORF-1)和开放阅读框2(ORF-2)基因的mRNA表达水平及拷贝数,LINE-1拷贝数增加反映其发生转座。Western blot检测LINE-1 ORF-1和ORF-2蛋白表达水平。

[结果] 与对照组比较,从第4天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-1 mRNA表达水平增加(P < 0.05),从第6天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-2 mRNA表达水平增加(P < 0.05)。染毒第10天时,与对照组(LINE-1 ORF-1:2.74±0.51;LINE-1 ORF-2:0.57±0.10)相比,PCB153染毒组的LINE-1 ORF-1蛋白表达水平(4.39±0.85)和LINE-1 ORF-2蛋白表达水平(0.78±0.10)均明显增加(P < 0.05)。染毒第10天时,PCB153染毒组与对照组的LINE-1 ORF-1拷贝数分别为1.43±0.64和0.83±0.37,LINE-1 ORF-2拷贝数分别为1.11±0.52和0.81±0.12,差异均具有统计学意义(P < 0.05)。

[结论] PCB153暴露可增加LINE-1的表达和拷贝数,诱导其转座。

关键词: PCB153;  人肾上皮细胞;  LINE-1 基因表达;  拷贝数;  转座 

多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是一类具有持久性、生物蓄积性、高毒性的有机污染物。PCBs可干扰细胞的代谢过程, 影响机体的稳态, 可能会引起代谢紊乱、生殖毒性、神经发育毒性、癌症等危害。有研究表明, PCBs暴露能够降低机体基因组甲基化水平, 并影响基因组稳定性[1]。长散在重复序列-1 (long interspersed nuclear element-1, LINE-1)是人类基因组中唯一可以自主转座的逆转座子, 占人类基因组的17%~20% [2]。由于LINE-1在人类基因组中数量巨大, 所以可在一定程度上代表整体基因组, 其转座可降低基因组稳定性, 加剧DNA损伤[3]LINE-1开放阅读框1 (open read framework 1, ORF-1)和开放阅读框2 (open read framework 2, ORF-2)编码的蛋白质可以介导LINE-1转座。结肠癌、肝癌、乳腺癌等癌组织存在大量的LINE-1转座, 其转座位置具有随机性[4-6], 并且LINE-1在生殖细胞的转座最为活跃[7]。除生殖细胞和癌细胞外, UPTON等[8]研究发现, 正常人的脑组织中也存在LINE-1转座, 其转座与神经细胞的功能发挥有关。LINE-1的转座可由其拷贝数增加间接反映。目前, 对于PCBs通过激活LINE-1致机体损伤机制的研究较少。本研究拟分析人肾上皮细胞系293T细胞在2, 2', 4, 4', 5, 5'-六氯联苯(PCB153)暴露下LINE-1的表达及转座效应, 为PCBs分子毒性的研究提供新思路。

1   材料与方法

1.1   主要试剂与仪器

PCB153 (纯度>99%) (Accustandard, 美国), 胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco, 美国), DMEM培养基(Corning, 美国), 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) (Sigma, 美国), Trizo(l Life Technologies, 美国), RIPA蛋白裂解液、三羟甲基氨基甲烷、吐温-20 (北京索莱宝科技有限公司, 中国), 二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher, 美国), 氯化钠(天津光复精细化工有限公司, 中国), 逆转录试剂盒(Promega, 美国), 实时荧光定量PCR试剂盒(Invitrogen, 美国), Axygen DNA提取试剂盒(Corning, 美国), Nanodrop2000微量紫外分光光度计(Thermo Fisher, 美国), Eco实时荧光定量PCR仪(Illumina, 美国), Tanon 5200全自动化学发光成像仪(上海天能公司, 中国), 引物合成于上海生工生物工程公司。

1.2   细胞培养及染毒

在37℃、体积分数5% CO2的条件下, 将293T细胞培养在含质量分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中, 当细胞处于对数生长期时进行染毒。PCB153染毒溶液的配制:准确称取适量的PCB153, 用DMSO配制成5 μmol/L PCB153溶液。实验中PCB153染毒组及对照组的DMSO质量分数均为0.05% [9-10]。经查阅文献发现:在多种细胞的剂量-反应曲线中, PCB153浓度达到5 μmol/L时, 细胞的生存率相对较高, 此时的PCB153对细胞无毒性作用, 染毒组细胞状态与对照组相比无差异[9]。故本研究最终选择5 μmol/L进行染毒。实验共分对照组和PCB153染毒组(5 μmol/L) 2组, 染毒实验分为两个部分。一为连续染毒, 293T细胞每2 d传代一次, 传代后染毒组立即进行染毒, 染毒后的细胞置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中继续培养, 连续染毒10 d。采用细胞计数板的方式进行计数, 确保各组平行样本之间的细胞数量大致相同。二为细胞收集, 实验中293T细胞每2 d传代一次, 胰酶消化后, 离心半径为10 cm的离心机以1 000 r/min离心5 min, 收集细胞。

1.3   LINE-1 ORF-1ORF-2 mRNA表达水平检测

Trizol法提取收集的293T细胞总RNA, 采用微量紫外分光光度计测定RNA的纯度(D260/D280在1.8~2.0为宜)。1μg总RNA通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA。以cDNA产物为模板, 在实时荧光定量PCR仪上检测ORF-1ORF-2 mRNA的相对表达量。反应条件为: 95℃ 10min, 95℃ 10s, 60℃ 30s, 72℃ 20s; 35个循环。采用2-ΔΔCt进行相对定量分析。引物序列为: LINE-1 ORF1-F: 5'-TGGCGAGGATGTGGAGAA-3'; LINE-1 ORF1-R: 5'-CCTGCAATCCCACCAACAAT-3'; LINE-1 ORF2-F: 5'-GAACCAAGACCACTCACCATCA-3'; LINE-1 ORF2-R: 5'-CCCTGGACTGGGCGAAGT-3'。

1.4   LINE-1 ORF-1和LINE-1 ORF-2蛋白表达水平检测

RIPA裂解法提取收集293T细胞总蛋白, 采用BCA法检测蛋白浓度。Western blot法检测ORF-1ORF-2的蛋白表达量。SDS-PAGE进行蛋白分离, 上样蛋白量为30 μg/孔, 恒压电流, 堆积胶80 V, 分离胶120 V, 电泳至凝胶3/4处。湿转法进行蛋白转膜, 冰浴中以100 V恒压电转60 min, 质量分数5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。加入用封闭液稀释的一抗, 4℃轻摇过夜。次日, 取出一抗孵育的聚偏氟乙烯膜, TBST洗3次, 每次洗15 min; 然后, 按照质量比1: 10 000比例加入封闭液稀释的二抗, 室温轻摇2 h。取出二抗孵育的聚偏氟乙烯膜, TBST洗3次, 每次洗15 min, 辣根过氧化物酶化学发光法显色。

1.5   LINE-1 ORF-1LINE-1 ORF-2基因拷贝数检测

Axygen试剂盒提取收集293T细胞DNA, -20℃储存。用微量紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度(D260/280在1.8~2.0为宜)。以DNA为模板, 在实时荧光定量PCR仪上检测ORF-1ORF-2在基因组DNA上的相对量。反应条件: 95℃ 10 min, 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃ 20 s; 35个循环。内对照为FOXP2基因(在基因组拷贝数恒定为2), 每个样本进行目的基因扩增时均重复3次, 采用2-ΔΔCt进行相对定量分析。引物序列为: FOXP2-F: 5'-TGACATGCCAGCTTATCTGTTT-3'; FOXP2-R: 5'-GAGAAAAGCAATTTTCACAGTCC-3'; LINE-1 ORF1-F: 5'-GGCAGGGCACAGACAAAC-3'; LINE-1 ORF1-R: 5'-AGGGACCCACTTGAGGAG-3'; LINE-1 ORF2-F: 5'-GGATACATTCCTCGACAC-3'; LINE-1 ORF2-R: 5'-CTCCTCCTTGTACCTCTG-3'。

1.6   统计学分析

所得实验数据以x±s表示, 应用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析, 用t检验进行两两比较。双侧检验, 检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   PCB153对293T细胞中LINE-1 ORF-1ORF-2基因表达的影响

与对照组比较, 从第4天开始, 5 μmol/L PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-1 mRNA表达水平明显升高, 差异有统计学意义(P < 0.05);从第6天开始, LINE-1 ORF-2 mRNA表达水平明显升高, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 1

图 1

PCB153对293T细胞中LINE-1 ORF-1(A)和LINE-1 ORF-2(B)mRNA表达的影响

Figure1.The effects of PCB153 treatment on LINE-1 ORF-1 (A)and LINE-1 ORF-2 (B)mRNA expressions in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.

染毒10 d时: 5μmol/L PCB153染毒组与对照组的LINE-1 ORF-1灰度值分别为4.39±0.85和2.74±0.51, 差异具有统计学意义(P < 0.05); LINE-1 ORF-2灰度值分别为0.78±0.10和0.57±0.10, 差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图 2

图 2

PCB153染毒10d对293T细胞中LINE-1 ORF-1和LINE-1 ORF-2蛋白表达(A)和灰度值(B)的影响

Figure2.The effects of PCB153 treatment for 10 days on LINE-1 ORF-1 and LINE-1 ORF-2 protein expression levels (A)and gray values (B)in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.

2.2   PCB153对293T细胞中LINE-1 ORF-1ORF-2基因拷贝数的影响

染毒10 d时: 5μmol/L PCB153染毒组与对照组的LINE-1 ORF-1拷贝数的相对表达量分别为1.43±0.64和0.83±0.37, 差异具有统计学意义(P < 0.05); LINE-1 ORF-2拷贝数的相对表达量分别为1.11±0.52和0.81± 0.12, 差异也具有统计学意义(P < 0.05)。见图 3

图 3

PCB153染毒10 d对293T细胞中LINE-1 ORF-1LINE-1 ORF-2基因拷贝数的影响

Figure3.The effects of PCB153 treatment for 10 days on LINE-1 ORF-1 and LINE-1 ORF-2 copy numbers in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.

3   讨论

据世界卫生组织报道, 西欧和东欧人体内PCBs含量较高, 其中捷克和斯洛伐克人群体内PCBs含量最高[11]。我国广州贵屿、浙江台州、天津静海人群体内PCBs含量较高, 这些地区存在电子垃圾拆卸业, 可将产品中的PCBs释放到环境中[12]。PCBs暴露与乳腺癌、肝癌、结肠癌的发生也存在一定的关系[4-6]。在前期实验中, 本课题组对天津静海电子垃圾区域进行了环境污染物浓度测定, 发现在该地区PCB153含量较高, 因此本研究选用电子垃圾处理区域含量较高的PCB153作为研究因素, 分析其对LINE-1转座的影响。

转座子是指可以在基因组上进行转座且具有高度重复的DNA元件, 在RNA的介导下, 可以由基因组的一个位置复制插入到另一个位置, 增加其在基因组上的拷贝数[13]。转座子约占全基因组的33%, 根据其转座活性可分为自主转座子和非自主转座子[14]LINE-1是人类基因组中唯一具有自主转座活性的转座子家族[15]

LINE-1基因全长约为6 kb, 其中ORF-1ORF-2编码的蛋白质, 可介导LINE-1的转座过程[13-14, 16]ORF-1蛋白具有核酸分子伴侣活性, 并且能保护核酸核蛋白体复合物中的LINE-1 mRNA免被降解, 确保逆转录正确起始等多种功能[17-20]。一般认为ORF-1蛋白主要作为ORF-2蛋白的辅助因子并能够与核酸结合[21]ORF-2蛋白具有核酸内切酶结构域、反转录酶结构域及锌指样结构域。在LINE-1 mRNA进入细胞核后, 负责识别在宿主细胞基因组DNA上的目的序列, 在靶点引导逆转录过程中发挥重要作用[2]

293T细胞是一种人肾上皮细胞系, 是实验室内应用比较广泛且较容易获得的一种非癌的人体细胞。本研究发现, 在5 μmol/L PCB153的刺激下, 染毒10 d时, 293T细胞中LINE-1ORF-1ORF-2表达量均增加, 且无论是在mRNA还是在蛋白水平上, PCB153染毒组ORF-1的表达量均高于ORF-2的表达量。这与ESTÉCIO等[22]的研究结果一致, 他们研究发现LINE-1ORF-1的表达量是ORF-2的千倍以上, 认为ORF-1有可能单独具有其他特定功能。LINE-1的激活与表达可导致各种类型的基因组不稳定, 如基因突变、基因扩增[23-24]。这些异常突变可能通过基因调控途径影响细胞, 诱导肿瘤细胞增殖, 从而增加结肠癌、肺癌等癌症的发病风险。即便LINE-1不是通过转座插入和ORF-2造成的基因损伤来诱致肿瘤发生, 也可能在肿瘤发展的过程中促进相关基因表达, 对肿瘤发生发展所需要的人体内环境具有重要的调控作用。

综上所述, PCB153可致293T细胞LINE-1表达及拷贝数增加, 反映其发生转座。但是目前关于PCB153致细胞中LINE-1转座调控模式的机制尚未明确, 仍需进一步的研究。

图 1

PCB153对293T细胞中LINE-1 ORF-1(A)和LINE-1 ORF-2(B)mRNA表达的影响

Figure 1 The effects of PCB153 treatment on LINE-1 ORF-1 (A)and LINE-1 ORF-2 (B)mRNA expressions in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.
图 2

PCB153染毒10d对293T细胞中LINE-1 ORF-1和LINE-1 ORF-2蛋白表达(A)和灰度值(B)的影响

Figure 2 The effects of PCB153 treatment for 10 days on LINE-1 ORF-1 and LINE-1 ORF-2 protein expression levels (A)and gray values (B)in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.
图 3

PCB153染毒10 d对293T细胞中LINE-1 ORF-1LINE-1 ORF-2基因拷贝数的影响

Figure 3 The effects of PCB153 treatment for 10 days on LINE-1 ORF-1 and LINE-1 ORF-2 copy numbers in 293T cells

[注]*:与对照组相比, P < 0.05。 [Note]*: Compared to the control group, P < 0.05.

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[收稿日期] 2017-07-19

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