《环境与职业医学》杂志官方网站 《环境与职业医学》杂志官方网站

首页> 过刊浏览> 正文

2018, 35(3):228-233.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17494

邻苯二甲酸单乙基己基酯对小鼠胚胎干细胞多能性相关转录因子表达的影响


沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室, 辽宁 沈阳 110034

收稿日期: 2017-08-07;  录用日期:2018-01-22;  发布日期: 2018-05-21

基金项目: 辽宁省自然科学基金项目(编号:2015020397);辽宁省大学生创业计划项目(编号:20141064000006);沈阳医学院科学研究基金(编号:20145065,20151001)

通信作者: 马明月, Email: mymacmu@163.com  

作者简介: 李玉秋(1989-), 女, 硕士生; 研究方向:生殖发育毒性与出生缺陷; E-mail:

[目的] 研究邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)对小鼠胚胎干细胞多能性维持能力的影响。

[方法] 不同浓度的MEHP(0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L)处理小鼠胚胎干细胞(mESCs)4 d,观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞凋亡指标;应用碱性磷酸酶染色法、real-time PCR及Western blot分别检测其分化情况、胚胎干细胞多能性相关转录因子SOX2OCT4基因及其蛋白表达水平。

[结果] 随着MEHP染毒浓度的增加,mESCs克隆的细胞团逐渐缩小,且数量也出现减少,以1 000 μmol/L组尤为明显;细胞凋亡检测结果发现,随着染毒浓度增加,凋亡率呈增加趋势,与对照组相比,仅1 000 μmol/L组mESCs总细胞凋亡率[(9.58±2.02)%]的升高有统计学意义(P < 0.05)。碱性磷酸酶染色结果显示,1 000 μmol/L组mESCs着色较浅,甚至未着色,即出现分化倾向,而其他组mESCs均被染成深蓝色或蓝紫色。与对照组相比,100、1 000 μmol/L组中SOX2OCT4基因表达降低(均P < 0.05);1 000μmol/L组SOX2、OCT4蛋白表达降低(均P < 0.05)。

[结论] 一定浓度MEHP对mESCs存在细胞毒性,抑制mESCs正常生长,降低mESCs中多能性相关转录因子SOX2OCT4的表达,进而影响胚胎早期发育。

关键词: 小鼠胚胎干细胞;  邻苯二甲酸单乙基己基酯;  细胞毒性;  转录因子;  SOX2 OCT4 

邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是环境内分泌干扰物中具代表性的一类物质,因其具有独特的理化性质而被广泛应用于各制造行业中,如食品包装材料、塑料制品、医用血袋、儿童玩具、个人护理用品等,其全球年产量已超800万t [1-2]。邻苯二甲酸二乙基己基酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]是PAEs中应用最广泛的一种化合物,在体内代谢活化可生成毒性更强的单酯化合物——邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono (2-ethylhexyl)phthalate,MEHP] [3]。DEHP具有生殖毒性,已被列入了优先控制的污染物名单[4-5]。自2006到2016年,美国开展了一项关于DEHP暴露情况的研究,发现成人DEHP、MEHP的暴露水平呈上升趋势[6],人们正处于DEHP高暴露的危险中。更有研究发现,DEHP及MEHP可透过胎盘屏障,能够进入胎儿体内,从而对不同阶段的胚胎发育产生不同程度的影响[7]

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是一种多能性细胞,具有无限增殖和自我更新的特性,在体内外均能经诱导而分化为机体内的几乎所有类型细胞[8-9]。ESC用于评价化学物的毒作用时,具有高准确性、高灵敏性、快反应性、少干扰性等优点[10],且其体外培养技术也已渐趋成熟,是体外替代试验中较好的受试对象。本研究通过体外培养小鼠ESCs,结合基因、蛋白表达检测,研究MEHP对小鼠ESCs多能性相关转录因子表达的影响,为鉴定其胚胎毒性及进一步的机制研究提供依据。

1   材料与方法

1.1   细胞

小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs,M1系)、小鼠胚胎成纤维细胞(C57/BL6) (mouse embryonic fibroblast,MEF)购自于上海斯丹赛生物技术有限公司。

1.2   仪器和试剂

SeriesII 3 110 CO2培养箱、ST 16离心机、NanoDrop分光光度仪(Thermo,美国),超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,中国),倒置显微镜(中国北京欣惠泽奥科技有限公司,中国),酶标仪(Molecular Device,美国),7500 FAST PCR仪(ABI,美国),细胞凋亡检测仪(Muse,德国),电泳仪(北京六一仪器厂,中国)。MEHP (质量分数98%,Pharmachem,美国),Annexin V-FITC Apoptosis试剂盒、MEHP标准品、蛋白裂解液、HRP标记的兔抗鼠二抗(南京建成有限公司,中国),cDNA逆转录试剂盒、MiniBEST Universal RNA提取试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(TaKaRa,日本),碱性磷酸酶染色试剂盒(上海斯丹赛生物技术有限公司,中国),SOX2抗体、OCT4抗体(CST,德国)。

1.3   方法

1.3.1   mESCs的培养与处理

将复苏的MEF种于铺有明胶的培养瓶中,37℃、5% (体积分数)CO2的培养箱中培养2 d,用于支持培养mESC。待MEF成熟后,吸弃MEF培养液,用1 mL mESCs完全培养液润洗后,将mESCs种入其中,隔天换液,观察ESCs的生长状态,大约5~7 d后,mESCs可传代。用不同浓度的MEHP (0、0.1、1、10、100、1 000μmol/L)处理mESC 4 d。

1.3.2   mESCS细胞形态和凋亡

检测显微镜下观察受试物处理后的mESCs形态改变;细胞凋亡检测按照Annexin V-FITC Apoptosis试剂盒说明书进行操作,并进行三次独立重复试验。

1.3.3   MEHP对mESCs细胞多能性的影响

(1)未分化mESCS鉴定:采用碱性磷酸酶染色法检测mESCs是否出现分化。将成熟后的mESCS用胰酶消化,传代种入铺有基质胶的24孔板中,待5~7 d细胞成熟后,按试剂盒说明书进行鉴定。未分化的mESCs将染为蓝紫色,已分化的mESCs及MEF细胞不着色。(2)基因表达检测:按试剂说明书提取总RNA后,用cDNA逆转录试剂盒按其说明书将RNA反转录合成cDNA。用SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒于Applied Biosystems 7500 Fast PCR仪上进行real-time PCR,检测mESCs多能性维持基因SOX2OCT4的表达水平。引物由Biological Industries公司合成提供,β-actin为内参,引物序列见表 1。(3)蛋白表达检测:按蛋白提取试剂盒的说明书提取蛋白,以BCA法测定蛋白浓度,用Western blot法测定β-actin (内参)、OCT4、SOX2蛋白表达情况。

表1

Real-time PCR引物序列

Table1.Primer sequences for real-time PCR

1.4   统计学分析

用Excel 2010整理三次独立重复的实验数据。实验数据以x±s表示,采用SPSS 22.0进行数据分析。符合正态分布并且方差齐的数据,用单因素方差分析(one-way ANOVA),与对照组比较采用Dunnett-t检验;不符合者,用非参数检验方法进行分析。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   mESCs形态学改变

镜下观察不同浓度MEHP处理4 d后,与对照相比,100和1 000 μmol/L组细胞团的大小和数量相对减少,而0.1、1和10μmol/L组变化不明显(见图 1)。

图 1

镜下观察MEHP对mESCs细胞形态的影响(×200)

Figure1.Effects of MEHP on mESCs morphology observed by miscroscope

[注(Note)] A:0 μmol/L[对照组(control group)];B:0.1 μmol/L;C:1μmol/L;D:10μmol/L;E:100μmol/L;F:1 000μmol/L。

2.2   MEHP对mESCs凋亡的影响

与对照组[(3.45±0.31)%]相比发现,1000μmol/L组的细胞总凋亡率[(9.58±2.02)%]明显增加(P < 0.05),其他组无明显变化。其他凋亡指标如早期凋亡率、晚期凋亡率及细胞碎片率等在各浓度组间的差异均无统计学意义(P>0.05) (见图 2)。

图 2

MEHP对mESCs细胞凋亡的影响

Figure2.Effects of MEHP on apoptosis of mESCs

[注]*:与对照组相比,P < 0.05。 [Note]*: Compared with the control group, P < 0.05.

2.3   mESCs细胞的未分化鉴定

碱性磷酸酶染色结果发现,mESCs的着色情况在1 000 μmol/L组出现了明显减淡,甚至不着色,并且着色细胞团数也有所减少,即细胞出现分化(见图 3A)。碱性磷酸酶活性分析发现,1 000 μmol/L组的酶活性明显下降(P < 0.05),即细胞已出现分化(见图 3B)。

图 3

MEHP对mESCs碱性磷酸酶的影响

Figure3.Effects of MEHP on alkaline phosphatase in mESCs

[注]A:碱性磷酸酶染色(×200)。A1:0 μmol/L(对照组);A2:0.1 μmol/L;A3:1 μmol/L;A4:10 μmol/L;A5:100 μmol/L;A6:1 000μmol/L。B:碱性磷酸酶活性。*:与对照组比较,P < 0.05。 [Note] A: Alkaline phosphatase staining(×200). A1: 0 μmol/L(control group); A2: 0.1 μmol/L; A3: 1 μmol/L; A4: 10 μmol/L; A5: 100 μmol/L; A6: 1 000 μmol/L. B: alkaline phosphatase activity. *: Compared with the control group, P < 0.05.

2.4   MEHP对mESCs多能性维持基因表达的影响

由于0.1 μmol/L MEHP对在细胞形态和细胞凋亡均无明显影响,因此后续基因及蛋白均未对该组进行检测。与对照组相比,10 μmol/L组的mESCs SOX2基因相对表达量开始出现下降,但结果差异无统计学意义(P > 0.05);在100和1 000 μmol/L组中,SOX2基因表达出现明显下降(P < 0.05)。对于OCT4基因,100μmol/L组中其表达量开始出现明显下降(P < 0.05),而在1 000 μmol/L组中,其基因表达水平未被检测到(见图 4)。

图 4

MEHP对多能性转录因子SOX2OCT4 mRNA表达的影响

Figure4.Effects of MEHP on mRNA expression of pluripotency-related transcription factors SOX2 and OCT4

[注]1 000μmol/L组未检测到OCT4表达;*:与对照组比,P < 0.05。 [Note]OCT4 mRNA expression of 1 000 μmol/L group was not detected; *: Compared with the control group, P < 0.05.

2.5   MEHP对SOX2和OCT4蛋白表达的影响

与对照组相比,1 000 μmol/L组SOX2、OCT4蛋白相对表达量均明显低于对照组(均P < 0.05),其他剂量组的变化不明显(见图 5)。

图 5

mESCs多能性转录因子SOX2、OCT4蛋白表达

Figure5.Protein expressions of pluripotency-related transcription factors SOX2 and OCT4 in mESCs

[注]*:与对照组比较,P < 0.05。 [Note]*: Compared with the control group, P < 0.05.

3   讨论

目前DEHP对人体健康造成的危害广受社会关注,已有研究证实,DEHP及其代谢产物MEHP具有发育毒性,然而其毒作用机制尚未明确[11-12]。随着干细胞研究方法日趋成熟,ESCs已成为发育毒性试验的一种新的受试对象,用于评价化学物的发育毒性作用[13-14]。早期胚胎发育的机制研究,较多集中于早期发育的核心调控转录因子。OCT4Nanog (一种干细胞多能性维持基因)被认为是维持ESCs的基本特性和早期发育的两个基本调节器,SOX2则是通过与OCT4组成异二聚体从而发挥协同调控作用[15]。因此,SOX2和OCT4的表达水平和功能状态直接影响ESCs多能性的维持及生物的早期发育。OCT4和SOX2既能够维持细胞的自我更新,同时,又能够抑制分化基因的表达,保持ESCs的多能性。如果此二者表达量降低,那么ESCs会趋于分化生长[16-17]。通过结合标记因子的基因、蛋白表达情况检测,可以判断出受试物对ESCs生长情况的影响。有研究报道,如果成体细胞中的SOX2、OCT4和Nanog过量表达,那么就能恢复其多能干细胞的特性[18]SOX2OCT4可以通过协同作用的方式来激活OCT-SOX增强子,从而调节干细胞特异性基因表达[19]。本研究采用不同浓度MEHP处理体外培养的mESCs,测定其对细胞凋亡、SOX2OCT4基因及蛋白表达情况的影响,探索MEHP对mESCs的毒作用及其可能的机制,为后续的实验提供依据[20]

本研究首先通过对mESCs是否发生分化进行鉴定确保其未分化后,将以不同浓度MEHP处理后的mESCs在镜下进行观察,发现对照组的mESCs呈现正常的克隆样生长,细胞团边缘清晰可见,呈现鸟巢状。随着MEHP浓度的增加,mESCs细胞团的数量逐渐减少、变小[20]。之前的研究[21]发现,高浓度(1000μmol/L)的MEHP明显抑制mESCs的细胞活力(P < 0.05),其他剂量组的细胞活力虽出现降低,但无统计学意义。鉴定后进行细胞凋亡的检测,发现与对照组相比,高浓度(1 000μmol/L)组的总细胞凋亡率增加(P < 0.05),其他各浓度组未见增加(P > 0.05);而对于其他凋亡指标,如活细胞率、早期凋亡细胞率、晚期凋亡细胞率及细胞碎片率等,各浓度组与对照组相比均未有明显变化(P > 0.05),这些结果与SHI等[22]在人ESC所研究的结果一致,表明MEHP达到一定浓度后,可打破ESC的沉默状态,从而导致自我破坏程序被启动。

体外培养的mESCs,当其处于未分化状态时,细胞能够合成较高浓度的碱性磷酸酶,因此,用碱性磷酸酶染色法可以灵敏、直观地显示其分化状态[23]。本研究中,我们将处理后的mESCs进行碱性磷酸酶染色,结果发现:在1 000 μmol/L组中,着色的细胞团数量减少,且着色较浅,表明一定浓度的MEHP会使mESCs发生分化,从而影响mESCs的多能性维持。之后我们又对mESCs多能性核转录因子SOX2和OCT4进行了real-time PCR及Western blot检测,发现SOX2OCT4基因在100 μmol/L组中基因表达出现明显降低(P < 0.05),且随着染毒浓度的增加,其下降更为显著。同时,蛋白表达的结果与基因结果相对应,只是SOX2和OCT4在100 μmol/L组中蛋白表达降低结果差异无统计学意义,这可能是基因与蛋白表达之间存在时间的先后顺序所致,所以在100 μmol/L MEHP染毒时,SOX2OCT4基因表达出现明显降低,而蛋白表达却降低的不明显。本研究的结果显示当浓度增加到1 000 μmol/L时,OCT4的蛋白表达量发生了明显降低,说明此浓度的MEHP能紊乱mESCs的正常分化,致使其趋向于分化成为滋养层细胞,从而影响mESCs多能性的维持。

综上所述,一定浓度的MEHP会对mESCs产生细胞毒性,能够抑制mESCs的正常生长,降低多能性维持相关的SOX2OCT4基因和蛋白的表达,进而影响多能性维持,致使其向着异常的方向分化,导致胚胎早期发育受到影响。

表1

Real-time PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for real-time PCR

图 1

镜下观察MEHP对mESCs细胞形态的影响(×200)

Figure 1 Effects of MEHP on mESCs morphology observed by miscroscope

[注(Note)] A:0 μmol/L[对照组(control group)];B:0.1 μmol/L;C:1μmol/L;D:10μmol/L;E:100μmol/L;F:1 000μmol/L。
图 2

MEHP对mESCs细胞凋亡的影响

Figure 2 Effects of MEHP on apoptosis of mESCs

[注]*:与对照组相比,P < 0.05。 [Note]*: Compared with the control group, P < 0.05.
图 3

MEHP对mESCs碱性磷酸酶的影响

Figure 3 Effects of MEHP on alkaline phosphatase in mESCs

[注]A:碱性磷酸酶染色(×200)。A1:0 μmol/L(对照组);A2:0.1 μmol/L;A3:1 μmol/L;A4:10 μmol/L;A5:100 μmol/L;A6:1 000μmol/L。B:碱性磷酸酶活性。*:与对照组比较,P < 0.05。 [Note] A: Alkaline phosphatase staining(×200). A1: 0 μmol/L(control group); A2: 0.1 μmol/L; A3: 1 μmol/L; A4: 10 μmol/L; A5: 100 μmol/L; A6: 1 000 μmol/L. B: alkaline phosphatase activity. *: Compared with the control group, P < 0.05.
图 4

MEHP对多能性转录因子SOX2OCT4 mRNA表达的影响

Figure 4 Effects of MEHP on mRNA expression of pluripotency-related transcription factors SOX2 and OCT4

[注]1 000μmol/L组未检测到OCT4表达;*:与对照组比,P < 0.05。 [Note]OCT4 mRNA expression of 1 000 μmol/L group was not detected; *: Compared with the control group, P < 0.05.
图 5

mESCs多能性转录因子SOX2、OCT4蛋白表达

Figure 5 Protein expressions of pluripotency-related transcription factors SOX2 and OCT4 in mESCs

[注]*:与对照组比较,P < 0.05。 [Note]*: Compared with the control group, P < 0.05.

参考文献

[1]

CHIELLINI F, FERRI M, LATINI G. Physical-chemical assessment of di-(2-ethylhexyl) -phthalate leakage from poly (vinyl chloride) endotracheal tubes after application in high risk newborns[J]. Int J Pharm, 2011, 409(1/2):57-61.

[2]

RUDEL R A, PEROVICH L J. Endocrine disrupting chemicals in in door and outdoor air[J]. Atmos Environ, 2009, 43(1):170-181.

DOI: 10.1016/j.atmosenv.2008.09.025
[3]

杨文杰. DEHP和MEHP神经发育毒性的体外研究[D]. 武汉: 华中科技大学, 2010.

[4]

骆祝华, 黄翔玲, 叶德赞.环境内分泌干扰物-邻苯二甲酸酯的生物降解研究进展[J].应用与环境生物学报, 2008, 14:890-897.

[5]

LIU Q. Research progress on phthalate esters (PAEs) organic pollutants in the environment[J]. Chines Journal of EcoAgriculture, 2012, 20:968-975.

[6]

SILVA M J, WONG L Y, SAMANDAR E, et al. Exposure to di-2-ethylhexyl terephthalate in a convenience sample of U.S. adults from 2000 to 2016[J]. Arch Toxicol, 2017, 91(10):3287-3291.

DOI: 10.1007/s00204-017-1956-3
[7]

李玉秋, 马明月.邻苯二甲酸酯对胚胎发育毒作用及其机制的研究进展[J].环境与职业医学, 2016, 33(6):606-609.

[8]

SCHOLZ G, POHL I, GENSCHOW E. Embryotoxicity screening using embryonic stem cells in vitro:correlation to in vivo teratogenicity[J]. Cells Tissues Organs, 1999, 165(3/4):203-211.

[9]

SUKOYAN M A, KERKIS A Y, MELLO M R. Establishment of new murine embryonic stem cell lines for the generation of mouse models of human genetic diseases[J]. Braz J Med Biol Res, 2002, 35(5):535-542.

DOI: 10.1590/S0100-879X2002000500004
[10]

CLAIJ N, VANDER WAL A, DEKKER M, et al. DNA mismatch repair deficiency stimulates N-ethyl-N-nitrosoureain duced mutagenesis and lymphomagenesis[J]. Cancer Res, 2003, 63(9):2062-2066.

[11]

DO R P, STAHLHUT R W, PONZI D, et al. Non-monotonic dose effects of in utero exposure to d(i 2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) on testicular and serum testosterone and anogenital distance in male mouse fetuses[J]. Reprod Toxicol, 2012, 34(4):614-621.

DOI: 10.1016/j.reprotox.2012.09.006
[12]

TRANFO G, CAPOROSSI L, PACI E, et al. Urinary phthalate monoesters concentration in couples with infertility problems[J]. Toxicol Lett, 2012, 213(1):15-20.

DOI: 10.1016/j.toxlet.2011.11.033
[13]

ROHWEDEL J, GUAN K, HEGERT C, et al. Embryonic stem cells as an in vitro model for mutagenicity, cytotoxicity and embryotoxicity studies:present state and future prospects[J]. Toxicol in Vitro, 2001, 15(6):741-753.

DOI: 10.1016/S0887-2333(01)00074-1
[14]

TROSKO J E. Commentary on "toxicity testing in the 21st century:a vision and a strategy":stem cells and cellcell communication as fundamental targets in assessing the potential toxicity of chemicals[J]. Hum Exp Toxicol, 2010, 29(1):21-29.

DOI: 10.1177/0960327109354663
[15]

秦洁, 郭新, 桂耀庭, 等.胚胎干细胞分化过程中的表观遗传调控[J].生命科学, 2007, 19(3):316-320.

[16]

YOUNG R A. Control of the embryonic stem cell state[J]. Cell, 2011, 144(6):940-954.

DOI: 10.1016/j.cell.2011.01.032
[17]

WU C C, WU H J, WANG C H, et al. Akt suppresses DLK for maintaining self-renewal of mouse embryonic stem cells[J]. Cell Cycle, 2015, 14(8):1207-1217.

DOI: 10.1080/15384101.2015.1014144
[18]

PARK I H, ZHAO R, WEST J A, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors[J]. Nature, 2008, 415(7175):141-146.

[19]

MASUI S, NAKATAKE Y, TOYOOKA Y, et al. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells[J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(6):625-635.

DOI: 10.1038/ncb1589
[20]

李玉秋. 邻苯二甲酸单乙基己基酯对小鼠胚胎干细胞多能性维持的影响及机制研究[D]. 沈阳医学院, 2017.

[21]

李玉秋, 段志文, 裴秀从, 等. DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究[J].实用药物与临床, 2016, 19(8):925-928.

[22]

SHI C, CHEN X, CAI X H, et al. Cytotoxic effects of mono-(2-ethylhexyl) phthalate on human embryonic stem cells[J]. Chin Med J, 2013, 126(9):1714-1719.

[23]

DRAPER J S, PIGOTT C, THOMSON J A, et al. Surface antigens of human embryonic stem cells:changes upon differentiation in culture[J]. J Anat, 2002, 200(3):249-258.

DOI: 10.1046/j.1469-7580.2002.00030.x
上一张 下一张
上一张 下一张

[基金项目] 辽宁省自然科学基金项目(编号:2015020397);辽宁省大学生创业计划项目(编号:20141064000006);沈阳医学院科学研究基金(编号:20145065,20151001)

[作者简介]

[收稿日期] 2017-08-07

【点击复制中文】
【点击复制英文】
计量
  • PDF下载量 (530)
  • 文章访问量 (2553)
  • XML下载量 (2)
  • 被引次数 (0)

目录

邻苯二甲酸单乙基己基酯对小鼠胚胎干细胞多能性相关转录因子表达的影响

导出文件

格式

内容

导出 关闭
《环境与职业医学》杂志官方网站