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2019, 36(9):853-857, 863.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2019.19239

亚砷酸钠致人胚肺成纤维细胞损伤中自噬和凋亡的关系


包头医学院公共卫生学院, 内蒙古 包头 014040

收稿日期: 2019-04-12;  发布日期: 2019-09-30

基金项目: 国家自然科学基金(81660532);内蒙古科技计划项目(201502080)

通信作者: 王素华, Email: bt_wangsuhua@163.com  

作者简介:

王馨悦(1991-), 女, 硕士生; E-mail:1351537685@qq.com

利益冲突  无申报

[背景] 砷可导致细胞损伤,引起细胞自噬和凋亡,而细胞自噬与凋亡之间目前没有明确界限,二者关系目前尚不明确。

[目的] 探讨亚砷酸钠致人胚肺成纤维细胞(HELF)损伤中细胞自噬与凋亡的关系。

[方法] HELF细胞株培养3 d后传代,随机分为对照组、亚砷酸钠处理组(亚砷酸钠浓度分别为5、10、20 μmol/L)、自噬抑制组(20 μmol/L NaAsO2+5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤)、凋亡抑制组(20 μmol/L NaAsO2+20 μmol/L Caspase抑制剂z-VAD-FMK),染毒48 h后,MTT实验检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态学改变。提取细胞上清液、蛋白,ELISA法测定上清液中白介素(IL)-1β、IL-6、干扰素受体(IFN)-α含量。Western blot检测自噬相关蛋白p62和LC3的表达水平。Caspase试剂盒检测凋亡相关蛋白caspase3/7。

[结果] 各组细胞存活率在染毒12、24、48 h后均低于对照组(P < 0.05)。随着染毒浓度增加细胞形态学改变,由紧密的梭形逐渐变为松散的圆形。10、20 μmol/L砷染毒组HELF细胞上清液中IL-1β表达量升高(P < 0.05);各砷染毒组细胞培养上清液中促炎因子IL-6、IFN-α表达量高于对照组(P < 0.05);与20 μmol/L亚砷酸钠染毒组相比,自噬抑制组呈现促炎因子表达量升高的趋势,凋亡抑制组呈现降低的趋势。与对照组相比,砷染毒组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量呈升高的趋势,p62蛋白的表达量呈降低的趋势;与20 μmol/L亚砷酸钠染毒组相比,自噬抑制组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量降低(P < 0.05),p62蛋白表达量呈升高的趋势;凋亡抑制组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达水平呈升高趋势,p62蛋白的表达水平呈降低趋势。随着染毒浓度增加,与对照组相比,10、20 μmol/L砷暴露组凋亡相关蛋白caspase3/7表达量增多(P < 0.05);与20 μmol/L亚砷酸钠染毒组相比,自噬抑制组caspase3/7表达量升高(P < 0.05),凋亡抑制组表达量降低(P < 0.05)。

[结论] 亚砷酸钠染毒后可引起HELF发生炎症反应、细胞自噬和凋亡,且细胞自噬与凋亡之间可能存在一定的拮抗关系。

关键词: 砷;  人胚肺成纤维细胞;  炎性因子;  细胞自噬;  细胞凋亡 

砷是国际癌症机构认定的主要致癌物。在我国内蒙古地区,砷污染区主要分布在呼和浩特、包头等地,受影响人群众多,砷中毒病人逐年增加[1],是目前国内最严重的地方性砷中毒病区。内蒙古地区砷污染主要为饮水型,饮水中的砷化合物经消化道吸收进入循环系统,流经肺脏,导致呼吸系统损伤,严重者可导致肿瘤的发生[2],因此,肺脏是砷污染暴露的敏感器官之一。亚砷酸钠染毒可导致细胞存活率下降,形态发生改变。细胞炎性因子变化在参与调控机体炎症反应的过程中起到关键作用。白介素(interleukin,IL)-1β是在炎症反应启动过程中发挥核心作用的促炎细胞因子之一,参与机体各个系统的炎症反应和免疫调节。IL-6亦属于促炎细胞因子,其参与机体炎症、免疫调节和代谢等过程。当发生炎症刺激时,IL-6可被IL-1β和干扰素受体(interferon,IFN)-α诱导,由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞所释放,引起局部炎症反应,导致组织损伤。有研究表明,给予亚砷酸钠染毒后,大鼠肺泡灌洗液中炎性因子表达升高[3]

自噬是形成双层膜的自噬泡包裹胞质内的物质,然后与溶酶体融合消化掉内容物。细胞自噬是细胞程序性死亡形式之一[4],生理性自噬是细胞的自我保护机制,但自噬过度可导致代谢应激、细胞死亡等。研究发现,砷暴露致大鼠肺损伤的机制可能与细胞自噬功能紊乱有关[5]。砷暴露可使细胞自身自噬保护机制启动,但当细胞损伤达到一定程度时则发生凋亡,因此可以认为自噬是凋亡发生的前一阶段。透射电镜观察“自噬小体”是目前国际上认定自噬发生的金标准,是反映细胞内形态的重要技术手段[6]。当自噬被激活时,p62表达水平降低;当自噬被抑制时,自噬体发生积累,p62表达水平升高,p62蛋白水平增高是自噬损伤的标志之一。LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型,细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶切割,成为可溶形式的LC3-Ⅰ,分布于胞浆内。LC3-Ⅰ经过泛素化加工修饰,与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺共轭结合,成为LC3-Ⅱ,并定位于自噬体内膜和外膜[7]。因此,LC3和p62是细胞自噬水平的标志之一。

细胞凋亡是指由基因控制的细胞有序而独立地死亡,以维持内部环境的稳定[8]。研究发现3价砷可诱导小鼠肺泡巨噬细胞发生凋亡[9]。凋亡是正常的细胞死亡途径,诱导细胞凋亡也是砷产生细胞毒性的可能机制之一。Caspase3/7是细胞凋亡的执行者,在细胞凋亡过程中起重要作用[10]。细胞自噬与凋亡目前没有明确界限,本研究通过亚砷酸钠染毒人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF),观察染毒后细胞形态学、炎性因子、细胞自噬、细胞凋亡的变化,从而讨论在亚砷酸钠染毒后HELF中自噬与凋亡的关系。

1   材料与方法

1.1   实验细胞

HELF细胞株(人胚肺成纤维细胞,中国武汉普诺赛生命科技有限公司),细胞解冻后复苏,培养于10 cm细胞培养皿,37℃,5%CO2,每3 d更换一次培养基。

1.2   主要试剂与仪器

亚砷酸钠(纯度99%,中国成都艾科化学技术有限公司),胎牛血清、杜氏改良Eagle培养基、胰酶(以色列BI),IL-1β、IL-6、IFN-α试剂盒(中国南京建成公司),LC3、p62抗体(美国CST),caspase荧光试剂盒(美国Promega),细胞培养箱(美国Thermo),离心机(中国长沙湘仪仪器有限公司)。

1.3   细胞模型的建立及样品采集

HELF复苏后培养10 cm细胞培养皿中,加入完全培养液(DMEM+FBS),每3 d更换一次培养基,进行细胞传代、冻存。细胞培养后进行MTT实验。将细胞随机分为对照组、亚砷酸钠暴露组、自噬抑制组、凋亡抑制组。对照组常规培养,加入10 mL完全培养基;亚砷酸钠暴露组分别各加入10 mL浓度为5、10、20 μmol/L的NaAsO2溶液;自噬抑制组加入10 mL浓度为20 μmol/L的NaAsO2溶液及浓度为200 mmol/L的3-甲基腺嘌呤(3-meyhyladenine,3-MA)250μL;凋亡抑制组加入10 mL浓度为20 μmol/L的NaAsO2溶液及浓度为1 mmol/L的Caspase抑制剂z-VAD-FMK(后简称z-VAD)200 μL。染毒48h后提取细胞培养液上清液、蛋白进行后续实验。

1.4   细胞形态学观察及MTT实验

采用倒置显微镜观察细胞形态学改变,收集对数期细胞并调整细胞悬液浓度,将细胞单层培养于96孔板中,加入梯度浓度药物,5%CO2,37℃孵育48 h。每孔加入20 μL MTT溶液,继续培养4 h后,终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜,低速振荡10 min,溶解晶体。酶标仪预热,490 nm处测量各孔的光密度值(D),计算细胞存活率。

1.5   透射电镜观察细胞自噬小体

细胞染毒后取出,消化,10 000×g离心20 mim,弃去上清液,加入电镜专用戊二醛,4℃固定过夜。吸去固定液,用磷酸缓冲液冲洗样品3次,每次5 min,使用1%的锇酸溶液固定样品2 h,包埋剂:丙酮(体积比1:1)处理样品1 h,包埋剂:丙酮(体积比3:1)处理样品3 h,用试剂处理的样品隔夜,将样品掩埋,在70℃加热过夜,切成70 mm的切片,透射电镜观察HELF自噬体。

1.6   ELISA法检测IL-1β、IL-6、IFN-α

96孔板设标准孔、空白孔、样品孔。向标准孔中加入按比例稀释好的标准品,样品孔中加入50 μL样品,每孔加入生物素50 μL,盖上封板膜,轻轻震荡混匀,37℃孵育30 min。弃去孔内液体,每孔加入洗涤液300 μL,轻轻摇晃30 s,在吸水纸上拍干,如此重复5次。每孔加入亲和素50 μL,盖上封板膜,轻轻震荡混匀,37℃孵育30 min。弃去孔内液体,每孔加入洗涤液300 μL,轻轻摇晃30 s,在吸水纸上拍干,如此重复5次。每孔先后加入显色液A、B各50 μL,盖上封板膜,轻轻震荡混匀,室温避光孵育10 min。取出96孔板,加入终止液50μL终止反应。酶标仪于波长450nm处检测D值,根据D值计算出样品浓度。

1.7   Western blot法检测LC3A/B-Ⅰ、LC3A/B-Ⅱ、p62

细胞用缓冲液冲洗后加入裂解液,放入离心机12000×g、4℃、离心20min,提取细胞总蛋白。在采集的蛋白质样品中加入适量的SDS-PAGE蛋白样品缓冲液,100℃或沸水浴加热5min以上,以充分变性蛋白,随后将蛋白依次放入SDS-PAGE凝胶样品孔中,浓缩胶电压设置为80~100 V,分离胶电压设置为120 V,转膜。加入Western封闭液,在摇床上轻慢摇动,37℃封闭1 h。按照说明书分别加入一抗二抗,凝胶成像仪拍照。应用Quantity One、Gel pro analyzer、Image J等软件对Western blot条带进行定量分析,计算出相对值。

1.8   caspase3/7荧光检测

将96孔板从培养箱取出,平衡到室温。将100 μL Caspase-Glo试剂加入各组的96孔白色板上。用盖子或封闭膜覆盖板,并在振荡器上轻轻混合约30 s。室温(18~22℃)孵育2 h。在发光检测仪或带发光检测功能的多功能酶标仪上读取每个样品的荧光值。

1.9   统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。不同组间均数比较采用完全随机设计单因素方差分析,均数间两两比较方差齐时采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   细胞存活率及形态学变化

染毒后HELF细胞形态学发生改变,由正常的梭形变为圆形,且圆形数量增多(图 1)。各染毒组细胞随着染毒浓度和时间的增加,细胞存活率呈现逐渐下降的趋势;染毒48 h后,在20 μmol/L时细胞存活率降至约50%。各组细胞存活率在染毒12、24、48 h后均低于对照组(P < 0.05)。见图 2

图 1

亚砷酸钠染毒48 h后HELF细胞形态学改变(x100)

图 2

亚砷酸钠染毒后HELF细胞存活率的变化

2.2   炎性因子含量

与对照组相比,10、20 μmol/L亚砷酸钠染毒组HELF细胞上清液中IL-1β表达量升高,且在20 μmol/L时达到最高;与20 μmol/L组相比,自噬抑制组IL-1β表达量呈升高,凋亡抑制组呈降低的趋势。与对照组相比,各亚砷酸钠染毒组HELF细胞上清液中IL-6表达量升高;与20 μmol/L组相比,自噬抑制组IL-6表达量呈升高的趋势,凋亡抑制组降低(P < 0.05)。与对照组相比,各亚砷酸钠染毒组HELF细胞上清液中IFN-α表达量升高,且在20 μmol/L时达到最高;与20 μmol/L组相比,自噬抑制组IL-1β表达量升高(P < 0.05),凋亡抑制组呈降低的趋势。见表 1

表1

不同亚砷酸钠染毒后HELF细胞中IL-1β、IL-6、IFN-α含量(x±s

2.3   自噬小体

砷酸钠染毒48 h后,5 μmol/L组出现较少自噬小体;随着染毒浓度增加,10、20 μmol/L组自噬小体逐渐增加;且抑制细胞凋亡后凋亡抑制组(20 μmol/L NaAsO2+z-VAD)出现自噬小体,加入自噬抑制剂3-MA后自噬小体消失(图 3)。

图 3

亚砷酸钠染毒HELF细胞48 h后细胞中自噬小体(x100)

2.4   LC3A/B-Ⅰ、LC3A/B-Ⅱ、p62含量

亚砷酸钠染毒后,与对照组相比,各染毒组自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达量呈逐渐升高的趋势,p62表达量呈逐渐降低的趋势。与20μmol/L NaAsO2组相比,自噬抑制组LC3A/B-Ⅰ、LC3A/B-Ⅱ表达量降低(P < 0.05),凋亡抑制组表达量呈现升高的趋势。与20μmol/L NaAsO2组相比,自噬抑制组p62表达量升高(P < 0.05),凋亡抑制组p62表达量呈降低的趋势。见图 4

图 4

亚砷酸钠染毒后HELF细胞p62(A)、LC3A/B-Ⅰ(B)、LC3A/B-Ⅱ(C)蛋白表达水平

2.5   caspase3/7含量

结果显示,不同染毒组HELF中caspase3/7含量与对照组(32.8±1.9)相比,随着亚砷酸钠染毒浓度增加,caspase3/7含量呈现增高趋势(37.2±1.7、40.6±2.3、48.0±2.9),10、20μmol/L组差异有统计学意义(P < 0.05)。与20μmol/L NaAsO2组相比,自噬抑制组(20μmol/L NaAsO2+3-MA)中凋亡相关蛋白caspase3/7表达量增加(51.6±2.2),凋亡抑制组caspase3/7表达量减少(27.0±1.4)(P < 0.05)。见图 5

图 5

亚砷酸钠染毒后HELF细胞中caspase3/7表达水平

3   讨论

细胞形态及存活率是反映细胞是否发育良好的指标之一,有研究显示,低浓度砷可引起细胞增殖[11],高浓度可引起细胞凋亡,本实验选取亚砷酸钠浓度为抑制增殖浓度,随着染毒浓度增高,细胞存活率开始下降,并且随着染毒时间延长和染毒剂量增加,细胞形态学逐渐发生变化,由饱满的梭形变为圆形。培养细胞上清液中炎性因子的表达量可反映亚砷酸钠染毒后损伤程度,本实验显示,在染毒48 h后细胞促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-α明显升高,并在20 μmol/L时细胞炎性反应达到最大,说明该浓度砷暴露可导致HELF细胞发生损伤,炎症的发生可能是引起细胞自噬或凋亡的机制之一。

自噬是一种分解代谢的过程,通过溶酶体机制降解细胞内的成分[5, 12],是一个动态过程。根据自噬发生的分子机制、功能的不同可以将自噬分为微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperonemediated autophagy)、选择性自噬(selective autophagy)和巨自噬(macroautophagy)。在许多死亡细胞中观察到的自噬活性增加,可能不是细胞死亡的原因,而是作为一种细胞自卫机制,旨在拯救细胞免于死亡。因此,自噬可能实际上是代表细胞的生存机制。透射电镜显示,在亚砷酸钠染毒HELF细胞48 h后,5、10、20 μmol/L染毒组均出现自噬小体,随着染毒剂量的增加,自噬小体逐渐增多。Western blot实验结果显示:NaAsO2染毒后随着染毒剂量的增加,细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达水平逐渐上升,p62表达水平下降,在给予凋亡抑制剂z-VAD后,与20 μmol/L染毒组相比,凋亡抑制组(20 μmol/L NaAsO2+z-VAD)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达水平升高,p62表达降低,提示细胞凋亡被抑制后细胞自噬水平反而升高。在亚砷酸钠染毒48 h后,caspase3/7表达量随着染毒剂量的增加而增加,自噬抑制组(20 μmol/L NaAsO2+3-MA)caspase3/7表达量明显增高,在自噬抑制后细胞凋亡水平反而升高。细胞自噬和细胞凋亡是细胞的两种程序性细胞死亡方式[13-14],两者可能相互拮抗或相互促进,并且可能同时发生或相继发生[15]。在同一细胞中,相同的诱导因子可诱导不同细胞中的自噬或凋亡,或诱导自噬导致凋亡细胞死亡。具体分为:合作关系、对抗关系、推动关系[14, 16]。本次实验中在亚砷酸钠暴露HELF细胞48 h后,亚砷酸钠染毒可以导致HELF细胞损伤,引起细胞死亡率增高,细胞炎性反应增强,并随着时间与剂量的增加而损伤加重。在亚砷酸钠染毒导致HELF细胞损伤过程中,发生了细胞自噬与细胞凋亡,二者可能存在拮抗关系。今后需进一步从基因、信号通路方面深入研究,进一步阐明二者关系。

图 1

亚砷酸钠染毒48 h后HELF细胞形态学改变(x100)

Figure 1 [注]染毒组细胞形态变为圆形,且圆形数量增加。A:对照;B:5μmol/L;C:10μmol/L;D:20μmol/L;E:20μmol/L+3-MA;F:20μmol/L+z-VAD。
图 2

亚砷酸钠染毒后HELF细胞存活率的变化

Figure 2 [注] *:与对照组比较,P < 0.05。
表1

不同亚砷酸钠染毒后HELF细胞中IL-1β、IL-6、IFN-α含量(x±s

Table 1
图 3

亚砷酸钠染毒HELF细胞48 h后细胞中自噬小体(x100)

Figure 3 [注]红色箭头示自噬小体。A:对照;B:5 μmol/L;C:10 μmol/L;D:20μmol/L;E:20 μmol/L+3-MA;F:20μmol/L+z-VAD。
图 4

亚砷酸钠染毒后HELF细胞p62(A)、LC3A/B-Ⅰ(B)、LC3A/B-Ⅱ(C)蛋白表达水平

Figure 4 [注] a:与对照组相比,P < 0.05;b:与20 μmol/L组相比,P < 0.05。
图 5

亚砷酸钠染毒后HELF细胞中caspase3/7表达水平

Figure 5 [注] a:与对照组相比,P < 0.05;b:与20 μmol/L组相比,P < 0.05。

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[基金项目] 国家自然科学基金(81660532);内蒙古科技计划项目(201502080)

[作者简介]

王馨悦(1991-), 女, 硕士生; E-mail:1351537685@qq.com

1351537685@qq.com

[收稿日期] 2019-04-12

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