
不同浓度Al(mal)3处理48 h后神经元的MEA测定结果(n=6)
Figure1.Results of MEA measurement of neurons after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3 (n=6)
2022, 39(4):397-403.doi:10.11836/JEOM21327
铝是一种神经毒性金属元素,因其优良的物理化学特性,已广泛应用于工农业及日常生活中[1]。铝已被证明对中枢神经系统具有损害作用,也被认为与多种神经退行性疾病相关[2],其神经毒性症状主要有学习记忆能力的下降和轻度的认知功能障碍[3]。据报道,铝可以改变血脑屏障的通透性[4],并易于在海马组织中蓄积[5],海马是大脑发挥学习和记忆作用的重要区域[6]。课题组前期研究证实了铝会损害海马长时程增强(long term potentiation, LTP)[7]。铝诱导的LTP损伤可能是因神经元间信号传递受阻而致的神经元突触功能障碍。神经元之间通过突触连接形成神经元网络,研究铝对神经网络电活动的影响有助于阐明铝致神经行为损伤的机制[8]。
微小RNA(micro RNA, miRNA, miR)是一类长度为20~24个核苷酸的小分子非编码RNA[9],在机体中发挥着重要的作用。miRNA能够通过与目标信使RNA(message RNA, mRNA)的3' 非编码区(untranslated region, UTR)结合,使得目标mRNA降解或者抑制mRNA的翻译,从而负向调控靶基因的表达[10-11]。近年来,有越来越多的研究者探索了miRNA在神经退行性疾病中的作用[9],如miR-219、miR-26等参与Tau蛋白的磷酸化,参与阿尔兹海默病发展进程[12-13]。miR-29是miRNA家族中的一员,由miR-29a、miR-29b和miR-29c构成[14],其中miR-29a在小鼠大脑神经元中高表达[15],且在阿尔茨海默病时有明显的降低[16]。
第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因[17],其主要功能是拮抗磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)依赖的蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)[18-19],在神经元生长和可塑性等多种中枢神经系统功能中起关键作用[20]。研究证实miR-29a与PTEN的3' UTR互补结合,且miR-29a-3p可以下调PTEN-3' UTR的荧光素酶的表达。同时又有研究发现,miR-29a能够靶向调控PTEN的表达,从而促进神经突起的生长,促进神经元网络的生成[21]。本实验拟通过建立体外小鼠原代海马神经元的麦芽酚铝[Al(mal)3]染毒模型,利用微电极阵列(micro-electrode array, MEA)的方法来研究铝对神经元网络电活动的影响,并阐明miR-29a/PTEN通路在其中的作用。
SPF级雄性及雌性ICR小鼠购于北京斯贝福生物技术有限公司,小鼠生产许可证号为SCXK(京)2019-0010,体重25~30 g,饲养于温度为22~25 ℃、12 h/12 h昼夜节律的洁净动物房,自由饮食饮水。本研究经山西医科大学实验动物伦理委员会审批(编号:2021-120),实验操作遵循国家有关实验动物管理和使用的规定。
Neurobasal-A培养液、B-27添加剂(美国Gibco),阿糖胞苷、氯化铝、麦芽酚(美国Sigma-Aldrich),miR-29a、U6引物(中国广州复能),反转录试剂盒(RR047A)、聚合酶链反应(PCR)试剂盒(RR820A)(日本Takara),PTEN引物(中国北京奥科鼎盛),慢病毒包被的miR-29a(中国上海吉凯),小鼠抗微管相关蛋白2(microtubule-associated protein2, MAP2)单克隆抗体(中国北京博奥森),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(中国北京康为世纪),兔抗PTEN多克隆抗体(美国Affinity Biosciences),羊抗兔IgG抗体(中国北京康为世纪),二氧化碳培养箱(美国Thermo),超净工作台(SW-CJ-2F型,中国苏州安泰),PCR仪(美国Applied Biosystems),MEA分析仪(美国Axion Biosystems),电泳仪(DYY-7C,中国北京六一),转膜仪(美国Bio-Rad),高压灭菌锅(中国福建致微)。
取雌雄小鼠交配自然孕育的新生24 h内ICR乳鼠,在乙醇消毒后断头处死乳鼠并迅速分离双侧海马,将海马切成1 mm3小块。在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)溶液中吹打混匀并加入胰酶,在37 ℃水浴锅内消化 15 min后加入完全培养基终止消化。用200目(孔径75 μm)细胞网过滤制成单细胞悬液,200×g离心5 min,弃上清,加入适量无血清培养基将细胞悬液密度调为5×105个·mL−1,接种于多聚赖氨酸包被的12孔板,培养4 h后,换液。以后每隔3 d半量换液。培养至第3天时,更换含阿糖胞苷的无血清培养基。培养至第6天时,利用神经元特异性标志物MAP2通过免疫荧光化学的方法鉴定神经元的纯度。在荧光显微镜下计数绿色荧光细胞占视野中总细胞数的比例,即为神经元的纯度。
将原代神经元接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中培养,取生长状态良好的细胞分为对照组,10、20、40 μmol·L−1 Al(mal)3进行染毒,每组设置3个复孔,实验重复3次。48 h后更换培养液,然后加入10 μL的CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,用酶标仪测定在450 nm处的光密度(D)。按照下面的公式计算细胞存活率。细胞存活率=[(D实验孔−D空白孔)/(D对照孔−D空白孔)]×100%。
用慢病毒载体建立神经元miR-29a高表达体系。该载体选择Syn基因作为特异性启动子以增强神经元特异性表达,并连接绿色荧光蛋白基因mNG,以此作为对照组。选择生长状态良好带有绿色荧光mNG的细胞进行Al(mal)3染毒,实验分组为:mNG组、mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组、miR-29a组、miR-29a+20 μmol·L−1 Al(mal)3组。每孔接种1 mL密度为1×105个·mL−1的细胞悬液进行培养。待培养至第6天时,选择生长状态良好的细胞进行感染。弃上清液,每孔加入20 μL滴度为1×108的慢病毒,20 μL的25×感染试剂,加入无血清培养基使每孔的终体积为500 μL,混匀。12 h后换液,继续培养,72 h后显微镜下观察荧光强度。
按照上述方法培养原代神经元,培养至第10天时,使用不同浓度的Al(mal)3处理神经元,通过MEA分析仪检测[22]并记录0 h和48 h的自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数等参数;将慢病毒转染的神经元培养至第10天时,用MEA分析仪检测并记录0 h和48 h的电生理活动。将0 h的神经网络兴奋性相关参数值标化为100%作为基线值,48 h时的各组参数值分别与0 h的各参数值相比(结果以百分数表示),即得到48 h时各组神经元网络电活动的变化情况。
收集各组细胞置于1.5 mL无酶的微量离心管(EP管)中,按照总RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA,使用双蒸水(ddH2O)作为参比溶液,测定RNA在260 nm和280 nm处的光密度比值,记录测定的总RNA浓度。以总RNA为模板,反转录合成cDNA,配置20 μL的PCR反应体系,反应条件为:95 °C预变性30 s,PCR反应阶段为95 °C 5 s,60° C 34 s,40次循环;溶解曲线为95 °C 15 s,65 °C 1 min 和95 °C 15 s。基因的表达结果用Ct值来表示,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,计算2−ΔΔct确定基因的相对表达量,每次实验设置3个复孔,重复3次。各基因及GAPDH的引物见补充材料表S1。
根据哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书提取样品的总蛋白,采用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度,以4∶1的比例加入5×上样缓冲液,混匀,沸水煮5 min后4 ℃保存备用。配置10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶在恒压60 V分离蛋白,然后在恒定电流350 mA下将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%的脱脂牛奶封闭2 h,加入一抗(PTEN,1∶1 000)4 ℃孵育过夜,二抗(1∶3000)37 ℃孵育2 h,用电化学发光(ECL)超敏发光液显色,Quantity one 4.6.2软件对灰度值进行分析。
所有的实验数据使用SPSS 22.0进行分析,数据分析前均进行正态性和方差齐性检验。对于比较组间的差异采用完全随机设计的单因素方差分析,两两比较用LSD-t分析,数据结果使用
接种于MEA板上的小鼠海马原代神经元在Al(mal)3处理小鼠原代海马神经元48 h时,随着Al(mal)3浓度的升高,自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数均呈现下降的趋势。对照组神经元自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数变化幅度分别为207.56%±38.70%、73.19%±46.43%、75.42%±33.04%和117.13%±15.54%。20、40 μmol·L−1 Al(mal)3组分别下降到171.70%±28.08%、49.20%±23.23%、50.20%±18.18%、85.45%±20.30%和150.68%±26.15%、43.43%±15.54%、52.05%±26.31%、26.80%±8.29%,与对照组间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图1。
不同浓度Al(mal)3处理48 h后神经元的MEA测定结果(n=6)
Figure1.Results of MEA measurement of neurons after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3 (n=6)
小鼠原代海马神经元经Al(mal)3处理48 h后,随着Al(mal)3浓度的升高,miR-29a的表达逐渐降低,PTEN mRNA的表达水平逐渐升高。与对照组(1.00)相比,20、40 μmol·L−1 Al(mal)3组miR-29a的相对表达水平分别下降为0.74±0.09和0.62±0.12(均P<0.05),PTEN mRNA的相对表达水平分别升高为1.32±0.12和1.48±0.11(均P<0.05)。见图2。
不同浓度Al(mal)3处理小鼠海马神经元48 h后miR-29a和PTEN mPNA的表达(n=6)
Figure2.MiR-29a and PTEN mPNA expressions in hippocampal neurons of mice after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3 (n=6)
如图3所示,小鼠原代海马神经元经Al(mal)3处理48 h后,随着Al(mal)3浓度的升高,PTEN蛋白的表达量呈升高趋势。与对照组(1.00)相比,20 μmol·L−1和40 μmol·L−1 Al(mal)3组的PTEN蛋白相对表达量分别升高到1.29±0.12和1.82±0.10(均P<0.05)。
不同浓度Al(mal)3处理48 h后PTEN蛋白的表达(n=6)
Figure3.PTEN protein expression after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3(n=6)
通过转染miR-29a后,使小鼠原代海马神经元过表达miR-29a,并经过Al(mal)3处理48 h后,与mNG组相比,miR-29a组的自发放电频率、簇发放电频率和网络簇发放电频率明显升高(变化幅度分别为252.80%±62.03%、171.65%±56.30%和197.75%±27.12%,均P<0.05),而同步指数下降到109.88%±17.93%(P<0.05);mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组的自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数分别下降到123.28%±47.31%、66.62%±31.53% 70.60%±12.48%和52.86%±20.26%(均P<0.05)。与mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组相比,miR-29a+20 μmol·L−1 Al(mal)3组的自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数变化幅度分别升高至161.41%±42.13%、101.16%±30.63%、127.02%±29.58%和109.73%±15.61%(均P<0.05)。见图4。
转染miR-29a后神经元的MEA检测结果(n=6)
Figure4.MEA results of neurons after transfection with miR-29a (n=6)
RT-PCR结果如图5所示,在小鼠原代海马神经元受到Al(mal)3处理48 h后,与mNG组(1.00)相比,miR-29a组神经元PTEN mRNA相对表达量(0.67±0.11)明显下降(P<0.05);mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组表达量(1.32±0.12)明显升高(P<0.05)。与mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组比较,miR-29a+20 μmol·L−1 Al(mal)3组PTEN mRNA相对表达量降低为0.93±0.06(P<0.05)。
转染miR-29a后PTEN mRNA的表达(n=6)
Figure5.Expression of PTEN mRNA after transfection with miR-29a (n=6)
Western blotting检测结果显示(图6),与mNG组(1.00)相比,miR-29a组PTEN蛋白相对表达量(0.75±0.08)下降(P<0.05),mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组上升为1.46±0.15(P<0.05)。与mNG+20 μmol·L−1 Al(mal)3组比较,miR-29a+20 μmol·L−1 Al(mal)3组PTEN蛋白相对表达量降低为0.92±0.09(P<0.05)。
转染miR-29a后PTEN蛋白的表达(n=6)
Figure6.Expression of PTEN protein after transfection with miR-29a (n=6)
脑功能的正常发挥离不开神经元在脑内的信号传递,而脑内神经元信号传递的任一基本环节损伤,都会引起神经元活动异常,进而导致脑部疾病的发生。研究指出铝可以透过血脑屏障进入脑海马区致神经突触结构及功能损伤,甚至诱导神经元的死亡[7]。但是关于铝如何影响神经元网络损伤的文献报道较少。本研究采用ICR小鼠原代海马神经元作为铝染毒细胞模型,以避免体内复杂内环境的干扰[23-24],并采用MEA实时记录神经元电生理的特征。MEA利用细胞与电极之间形成的互相接触来检测细胞的膜电位,具有空间分布微电极的优势,可以测量由大量神经元组成的神经网络,因而避免未知参数的困境[22]。当神经元受到刺激后,可产生可扩布的动作电位,而锋电位是动作电位的主要组成成分,多个锋电位一起放电组成簇发放电[25]。当突触学习率增加,提高神经元的兴奋性时,神经元簇放电活动增强,平均簇放电频率增加[26]。1968年,Blaustein和Goldman[27]观察到铝显著降低了龙虾巨大轴突中去极化电流引起的动作电位,这是铝损伤神经传递的早期证据。在本次实验中,当铝作用于神经元后,神经元的自发放电频率、簇发放电频率和网络簇发放电频率明显降低,表明铝可能提高了静息电位的阈值。当神经元网络中神经元相互耦合,就会出现神经元同步放电的现象,当铝作用神经元后,发现神经元的同步放电指数降低。可见铝可显著抑制小鼠海马神经元网络电活动。
miRNA是一类广泛存在于生物体中的小分子RNA,能够在转录后水平调控基因的表达[28]。其主要是通过与目标mRNA的3' UTR结合,抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解来调控靶基因的表达[10]。miRNA在生长发育、神经元突起生长、凋亡等过程中发挥着重要作用[29]。研究者发现miR-29a表达降低与突触结构病理病变相关,miR-29a上调可通过直接降低双肾上腺皮质激素(doublecortin, DCX)[15],促进神经元突起分支化进程,促进PC12细胞[30]和N2a细胞[31]的突起生长,可见miR-29a参与神经元的生长及神经元网络的调节。本实验中,观察到Al(mal)3可使海马神经元miR-29a的表达降低,并且随着铝浓度的升高,miR-29a的表达量逐渐下降,呈现一定的剂量-反应关系,miR-29a可能是铝诱导的海马神经元网络损伤重要靶调控因子。有研究证实miR-29a与PTEN的3' UTR互补结合,且miR-29a-3p可以下调PTEN-3' UTR荧光素酶的表达[30]。课题组前期发现随着铝浓度的升高,大鼠海马神经元的Akt的表达逐渐下降,使下游的糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)磷酸化水平下降而活性升高,产生抑制大鼠海马CA1区电生理活动的作用[7]。通过查阅文献发现Akt的上游分子PTEN,而PTEN在中枢神经系统高度表达;同时前期实验研究发现大鼠海马神经元中miR-29a的表达水平随着染铝剂量的增加而下降[32],因此猜想miR-29a与PTEN可能存在关系,并进行了本次实验研究。
综上所述,本研究证明了铝染毒可引起小鼠原代海马神经元网络的损伤,并进一步以miR-29a为靶点证明了铝通过miR-29a/PTEN损伤海马神经元网络的机制,但海马神经元网络损伤的具体机制还有待进一步研究。
不同浓度Al(mal)3处理48 h后神经元的MEA测定结果(n=6)
Figure 1Results of MEA measurement of neurons after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3 (n=6)
不同浓度Al(mal)3处理小鼠海马神经元48 h后miR-29a和PTEN mPNA的表达(n=6)
Figure 2MiR-29a and PTEN mPNA expressions in hippocampal neurons of mice after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3 (n=6)
不同浓度Al(mal)3处理48 h后PTEN蛋白的表达(n=6)
Figure 3PTEN protein expression after 48 h of designed concentrations of Al(mal)3(n=6)
转染miR-29a后神经元的MEA检测结果(n=6)
Figure 4MEA results of neurons after transfection with miR-29a (n=6)
转染miR-29a后PTEN mRNA的表达(n=6)
Figure 5Expression of PTEN mRNA after transfection with miR-29a (n=6)
转染miR-29a后PTEN蛋白的表达(n=6)
Figure 6Expression of PTEN protein after transfection with miR-29a (n=6)
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[基金项目] 国家自然科学基金(81703202)
[作者简介]
[收稿日期] 2021-07-25
引用格式
向长鑫,
韩颖超,
李萌, 等.
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