
小鼠海马原代神经元纯度鉴定
Figure1.Purity identification of primary hippocampal neurons in mice
2021, 38(11):1207-1213.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.21085
铝(aluminum, Al)是地壳中含量最丰富的金属,高熔点、高沸点、低密度和耐腐蚀等良好的理化特性使得铝在工业和日常生活中得到了广泛的应用[1]。铝可与生物系统中生化反应的关键元素氧、碳、磷和硫等元素紧密结合,并对机体的多个系统造成潜在的影响[2]。研究表明,铝容易穿过血脑屏障进入大脑[3],并沉积在皮质、胼胝体和海马等部位,对中枢神经系统发挥毒性作用[4]。实验动物模型和人群研究证实,铝与透析性脑病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发病关系密切,并可致认知功能下降[5]。课题组前期研究发现铝可对神经突触结构和功能造成进行性不可逆的损伤[6-7],最终导致脑神经元死亡[8]。通过轴突和树突神经元互相连接,形成神经网络,维持正常的认知功能[9],但铝致神经元连接发生改变的机制尚未阐明。
在中枢神经系统高度表达的糖原合成酶-3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)与神经元活动关系密切[10],GSK-3β的活性受到了上游对其Ser9位点的抑制性磷酸化调节,Ser9位点去磷酸化可以激活GSK-3β,并参与记忆功能损伤的病变过程[11];特异性抑制GSK-3β的活性可以改善大鼠的学习和记忆障碍,调控突触的可塑性[12]。课题组前期研究结果发现,铝可通过影响GSK-3β的磷酸化水平,激活GSK-3β,进而影响长时程增强(long-term potentiation, LTP)[13]。Gozdz等[14]指出,GSK-3β可通过Arc参与调节神经元突起的改变,进而影响结构突触可塑性。细胞突起是神经元的重要组成部分,它们相互连接形成突触,并构成维持正常认知功能的基础。研究指出磷酸化脑衰反应调节蛋白2(collapsin response mediator protein 2, CRMP2)是GSK-3β的磷酸化底物,可参与调节神经元微管蛋白、肌动蛋白,与神经元突起损伤的关系密切[15]。Wakatsuki等[16]研究结果指出,GSK-3β活性被干预剂激活后,可增强其底物CRMP2 Thr514位点的磷酸化水平,导致CRMP2从微管解离,进而影响神经元的突起(轴突和树突)形成,导致神经元极性损伤和抑制神经元突起延伸。为了明确GSK-3β-CRMP2在铝致神经元突起损伤中的作用及机制,本研究对原代培养的小鼠海马神经元进行培养和铝染毒,应用GSK-3β的抑制剂进行干预,应用高内涵成像技术阐明铝致神经元突起损伤的分子机制,以期为铝神经毒性研究提供依据。
SPF级雄性ICR小鼠5只及雌性ICR小鼠10只(北京斯贝福生物技术有限公司,中国),生产许可证号为SCXK(京)2019—0010,体重18~20g,6~8周。
Neurobasal-A培养液、B27添加剂(Gibco,美国),多聚赖氨酸(Sigma,美国),胰蛋白酶-EDTA消化液、D-Hanks缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司,中国),麦芽酚、氯化铝(纯度为99%,Sigma-Aldrich,美国),蛋白抽提试剂盒、BCA试剂盒、鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、辣根酶标记羊抗兔IgG、辣根酶标记羊抗小鼠IgG(北京康为试剂有限公司,中国);微管相关蛋白2(microtubule-associated protein-2, MAP2)抗体(北京博奥森生物技术公司,中国);兔抗CRMP2抗体、兔抗p-CRMP2(Th514)抗体、兔抗p-GSK-3β(Ser9)抗体、兔抗GSK-3β抗体(Cell Signaling,美国),慢病毒包被的mNeonGreen、感染增强液、聚凝胺(合元生物,中国)。
二氧化碳培养箱(Thermo,美国),Milli-Q Reference超纯水机(深圳贺裕仪器仪表科技有限公司,中国),低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司,中国),酶标仪Modle 680(BIO-RAD,美国),SW-CJ-2F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司,中国),倒置荧光显微镜(OLYMPUS,日本),Operetta高内涵成像分析仪(PerkinElmer,美国)。
刚出生24 h以内的20只ICR小鼠用75%(体积分数)的乙醇浸泡2 min麻醉消毒并取脑放入含提前预冷的Hank's平衡盐溶液的细胞培养皿中;体视显微镜下用预先高压灭菌的纤维解剖镊子去除脑网膜,分离两侧海马,并转移至干净的培养皿中,刀片快速切碎后,用质量分数为0.125%的胰蛋白酶在37℃下消化5 min,将组织转移至含血清的DMEM培养基中终止消化,并将絮状团吹散,430×g离心3 min后弃上清;加入含B27添加剂(体积分数2%)和双抗(100 U·mL−1)的无血清Neurobasal-A培养基重悬神经元细胞,神经元细胞悬液浓度调整至每30 μL含1.5×105个细胞后,接种至已铺多聚赖氨酸的细胞培养6孔板中,并于37 ℃、5% (体积分数)CO2培养箱中培养。培养4 h后全量换液为无血清Neurobasal-A培养基,以后每3d进行半量换液,待细胞培养至第3天时,加入2.55 μg·mL−1阿糖胞苷干预作用24 h,抑制胶质细胞等非神经元的生长。所有实验操作均遵循单位和国家有关实验动物管理和使用的规定(无编号)。
待神经元细胞培养至第5天时,弃去培养液后置于摇床上,预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)清洗3次,每次5 min;多聚甲醛(质量分数4%)固定30 min ;0.3% Triton X-100通透30 min;5%免疫组化封闭血清室温封闭1 h,加入MAP2抗体(1∶100)于4℃过夜。PBS清洗3次,每次5 min;加入荧光标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)于37℃孵育2 h,经PBS充分漂洗后,加入DAPI(1∶1 000)避光染色30 min。于激光共聚焦下观察并选择一个视野计算神经元纯度。
为了增强神经元特异性表达结果,选择Syn基因作为特异性启动子,连接在带有新型绿色荧光蛋白mNeonGreen的载体上,待神经元培养至第7天时,加入慢病毒载体介导的mNeonGreen基因,转染12 h后采用不含病毒载体的DMEM完全培养基继续培养,每日于倒置荧光显微镜下观察荧光表达强度以进行后续实验。
按照前期的研究方法将配置好的不同浓度的氯化铝溶液和麦芽酚溶液按照1∶1等体积混合配制成终浓度为10 mmol·L−1的Al(mal)3溶液,并用滤膜(孔径为0.22 mm)对其进行抽滤,最终调整pH值至7.4左右;按照文献报道,GSK-3β的抑制剂SB216763(SB)溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中,现用现配[17]。本课题组前期Al(mal)3作用于大鼠皮质神经元的最高剂量为80 µmol·L−1,作用时间是24 h[18]。本次实验取材小鼠海马神经元,结合前期预实验细胞活力结果,在铝对细胞活力的影响较小,尽可能长时间观察毒理学效应的前提下,本研究在神经元细胞培养至第10天时,选择生长状态良好带有绿色荧光mNeonGreen的细胞进行Al(mal)3染毒48 h,实验分组为空白对照组、麦芽酚组(120 µmol·L−1)以及10、20、40 µmol·L−1Al组。为了确定SB拮抗的神经元突起损伤和下游信号分子,实验分组为空白对照组、DMSO组、Al(20 µmol·L−1)组、SB组(1 µmol·L−1)、SB(1 µmol·L−1)+Al(20 µmol·L−1)组。
实验按照CCK-8检测试剂盒说明步骤进行。将小鼠原代海马神经元以3×104个·孔−1种植于96孔板中培养5 d,选择细胞状态良好的细胞进行Al(mal)3染毒,每组设3个复孔,各组经处理后,吸弃培养基100 μL,加入10 μL CCK-8溶液,于37℃、5%(体积分数)CO2培养箱孵育2 h。使用酶标仪在450 nm 波长处测定光密度(D)值。
在Al(mal)3或SB处理海马原代神经元0、48 h时,用Operetta高内涵成像分析仪对神经元进行扫描,参数为时间100 ms,高度1 μm。扫描完成后,用Harmony 3.5.2图像分析软件根据神经元荧光的强度以及分布,对神经元突起分支数和突起长度的数据进行分析。
经处理后的海马原代神经元经PBS漂洗后,加入RIPA裂解液提取蛋白,用BCA法测定蛋白浓度,调整蛋白样品浓度后加入5×上样缓冲液,水浴煮沸5 min,−80℃保存以进行后续实验。将等量的蛋白质样品(10 μL)上样,经体积分数10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜后,将膜在质量分数5%脱脂牛奶中饱和封闭2h,然后在4℃条件下与相应的一抗孵育过夜,辣根酶标记的二抗孵育2 h。使用蛋白印记法检测免疫标记的蛋白条带,化学发光成像系统对蛋白条带进行扫描,使用Quantity one 4.6.6软件对蛋白条带进行灰度分析。
所有数据均用均数±标准差表示,用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析,用LSD 法分析各组间的差异。检验水准α=0.05。
在培养神经元到第5天时,经免疫组化实验染色法鉴定,神经元纯度大于90%(图1)。经Al(mal)3染毒48h后,与空白对照组相比,麦芽酚组细胞存活率无变化,10、20和40 µmol·L−1Al组细胞存活率下降(P<0.05)(图2A)。经SB处理48 h后,DMSO组、SB组细胞存活率与空白对照组之间的差异无统计学意义;与Al单独处理组相比,SB+Al联合处理组神经元的细胞存活率增加(P<0.05)(图2B)。
小鼠海马原代神经元纯度鉴定
Figure1.Purity identification of primary hippocampal neurons in mice
不同浓度铝(A)和SB216763(B)对原代小鼠海马神经元存活率的影响
Figure2.Viability rates of primary mouse hippocampal neurons with different concentrations of Al (A) or SB216763 (B) treatment
应用高内涵成像系统动态观察细胞形态发现,在0 h时间点,各组海马神经元细胞饱满、密集(图3),各组间神经元平均突起分支数、突起长度差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。48 h时,空白对照组神经元多条突起(轴突和树突)延伸变长,轴突和树突形成神经网络(图3),空白对照组神经元在48 h时的平均突起分支数、突起长度分别是0 h时的90.13%±11.70%、113.24%±8.34%(表1)。DMSO组神经元平均突起分支数量、突起长度与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。经过20 µmol·L−1 Al(mal)3处理48 h后,小鼠海马原代神经元突起分支数减少,突起变短、中断,突起间交错形成的网络状结构基本消失(图3),神经元平均突起分支数量、神经元平均突起长度分别是0 h时的56.47%±16.36%、62.06%±6.75%,且均低于空白对照组(P<0.05)(表1)。给予GSK-3β抑制剂SB 48 h后,SB组神经元平均突起分支数是0 h时的99.03%±21.83%,与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);SB组神经元平均突起长度是0 h时的128.72%±15.39%,高于空白对照组(P<0.05)。给予SB和Al联合处理48 h后,神经元平均突起分支数量、神经元平均突起长度分别是0 h时的72.60%±10.89%、93.84%±14.65%,与Al组比较,神经元平均突起分支数和平均突起长度增加(P<0.05)(表1)。
高内涵成像技术检测Al(mal)3和SB216763处理48h后海马神经元突起生长
Figure3.Neurite growth of hippocampal neurons with Al(mal)3 or SB216763 treatment detected by high content analysis system
SB216763和Al(mal)3对小鼠海马原代神经元神经突起的影响(
Effects of SB216763 and Al (Mal)3 on neurites of primary hippocampal neurons in mice (
如图4A所示,各组间GSK-3β蛋白水平差异无统计学意义(F=0.097,P>0.05)。如图4B所示,与空白对照组(1.00±0.18)相比,Al组神经元p-GSK-3β蛋白水平(0.45±0.05)降低,SB组p-GSK-3β蛋白水平(1.32±0.23)升高(F=14.737,P<0.05);SB+Al联合处理组p-GSK-3β蛋白水平(0.80±0.05)高于Al组(P<0.05)。如图4C所示,与空白对照组(1.00±0.07)相比,Al组CRMP2蛋白水平(0.66±0.11)降低(F=5.888,P<0.05),SB组CRMP2蛋白水平(1.01±0.02)无明显变化(P>0.05)。如图4D所示,与空白对照组(1.00±0.13)相比,Al组p-CRMP2蛋白水平(1.50±2.18)增加(F=12.194,P<0.05),SB组p-CRMP2蛋白水平(0.62±0.09)降低(P<0.05);与Al组相比,SB+Al联合处理组p-CRMP2蛋白水平(1.28±0.24)降低(P<0.05)。
小鼠海马原代神经元GSK-3β(A)、p-GSK-3β(B)、CRMP2(C)、p-CRMP2(D)蛋白表达水平
Figure4.Expressions of GSK-3β (A), p-GSK-3β (B), CRMP2 (C), and p-CRMP2 (D) in primary hippocampal neurons of mice
脑功能的稳定是确保人类正常生命活动的首要前提和基础,是中枢神经系统通过细胞表面、胞内信号分子在脑各个系统网络等多个层次的动态反馈调节过程,极容易受到环境因素的影响[19]。课题组前期研究结果指出铝可对神经突触结构和功能造成进行性不可逆的损伤:急性侧脑室和亚慢性腹腔注射染毒模型发现,铝可通过抑制α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体外化而损伤LTP[7],进而导致学习记忆能力损伤;李欢等[6]的研究指出,饮用水慢性染铝可致大鼠海马组织树突棘密度降低。细胞突起是神经元的重要组成部分,细胞突起相互交联成网,形成神经突触,神经突起生长模式及形态的改变会引起神经退行性疾病[20]。本研究发现,铝可致神经元突起分支数及长度降低,形态上扭曲断裂,影响神经元轴突与树突间的网络结构与突触联系。
突起生长是神经可塑性的重要基础,是通过细胞内信号通路调控生长和导向因子作用于细胞骨架的过程[21]。GSK-3β在神经发育和细胞骨架重组中起关键作用,参与记忆障碍的病变过程[15]。海马神经元中GSK-3β Ser9位点高度磷酸化致GSK-3β的活性增加,导致树突收缩,树突延伸受抑,提示GSK-3β是树突生长的关键靶点[22]。在本次研究中,Al(mal)3处理后降低了GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平,这一结果与前期大鼠侧脑室染铝致结果一致[13],前期研究结果发现GSK-3β通过β-catenin调控BDNF在铝致突触可塑性损伤中发挥重要作用。CRMP2与β-catenin都为GSK-3β的下游底物,在神经退行性疾病模型中都有变化,CRMP2是一种在神经元突起中高表达的重要的微管相关蛋白,CRMP2与突起形成有关;CRMP2与微管蛋白二聚体结合促进微管的装配[23-24],可以诱导突起的延伸,而Thr514位点磷酸化致p-CRMP2丧失微管聚合的能力,从而抑制突起的延伸[25]。研究者指出GSK-3β的失活是突起形成的必要条件[22],GSK-3β活性增强增加CRMP2(Thr514)的磷酸化水平,CRMP2从微管上解离加剧,最后致神经元突起退化,瓦勒变性加重[16]。在本次研究中,Al(mal)3降低了CRMP2的表达并可能与神经元突起分支数减少有关,同时Al(mal)3增加了CRMP2(Thr514)的磷酸化水平并可能与神经元长度减少有关。由于CRMP2是GSK-3β重要的下游靶标,这一结果提示铝暴露可能通过激活GSK-3β致CRMP2蛋白磷酸化水平变化并造成神经元突起损伤。
为证实GSK-3β-CRMP2在神经元突起生长中的作用,Yoshimura等[22]用另一种抑制剂NT-3处理海马神经元,GSK-3β活性受抑,CRMP2去磷酸化形式水平增加,海马神经元中突起(轴突)增加并延伸。本研究使用了一种小分子Wnt模拟物SB,其作用机制是通过增加Ser9位点处的磷酸化水平来抑制GSK-3β的活化[26]。结果发现,在未染铝时,SB组海马神经元GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平增加,CRMP2蛋白表达增加,CRMP2(Thr514)的磷酸化水平减少,神经元平均突起分支数有所增加,同时神经元平均突起长度增加;在铝处理后,神经元突起分支数及长度降低,再经SB与Al联合处理后,神经元平均突起数量、神经元平均突起长度增加,GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平增加,CRMP2(Thr514)的磷酸化水平减少,证实SB抑制了GSK-3β的活性,减少了CRMP2的磷酸化水平,减轻了铝致神经元突起损伤。SB与Al 联合处理组CRMP2 表达水平与Al组相比差异无统计学意义,可能与SB干预剂量或者样本量有关,但CRMP2 表达水平有轻度增加,其机制可能与 GSK-3β 活性被抑制后降低CRMP2(Thr514)的磷酸化水平,促进与微管蛋白的结合,促进神经元生长有关。
综上所述,铝染毒损伤小鼠海马神经元突起生长,致突起分支数减少,突起变短、中断。本研究进一步以GSK-3β为靶点对铝抑制神经元突起生长的机制进行了初步研究,推测铝暴露可能通过激活GSK-3β,增加CRMP2蛋白磷酸化水平,损伤神经元突起生长,但其调控机制仍需进一步探讨。
小鼠海马原代神经元纯度鉴定
Figure 1Purity identification of primary hippocampal neurons in mice
不同浓度铝(A)和SB216763(B)对原代小鼠海马神经元存活率的影响
Figure 2Viability rates of primary mouse hippocampal neurons with different concentrations of Al (A) or SB216763 (B) treatment
高内涵成像技术检测Al(mal)3和SB216763处理48h后海马神经元突起生长
Figure 3Neurite growth of hippocampal neurons with Al(mal)3 or SB216763 treatment detected by high content analysis system
SB216763和Al(mal)3对小鼠海马原代神经元神经突起的影响(
Effects of SB216763 and Al (Mal)3 on neurites of primary hippocampal neurons in mice (
小鼠海马原代神经元GSK-3β(A)、p-GSK-3β(B)、CRMP2(C)、p-CRMP2(D)蛋白表达水平
Figure 4Expressions of GSK-3β (A), p-GSK-3β (B), CRMP2 (C), and p-CRMP2 (D) in primary hippocampal neurons of mice
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[基金项目] 国家自然科学基金项目(81703202, 81872599)
[作者简介]
[收稿日期] 2021-03-07
引用格式
张慧芳,
韩颖超,
蔡小亚, 等.
麦芽酚铝通过GSK-3β调控CRMP2致小鼠海马神经元突起损伤的作用研究[J].环境与职业医学,
2021, 38(11): 1207-1213.
doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.21085.
ZHANG Huifang , HAN Yingchao , CAI Xiaoya , XIANG Changxin , NIU Qiao . Effect of aluminum-maltolate on primary hippocampal neuron neurite damage by regulating CRMP2 through GSK-3β in mice.Journal of Environmental & Occupational Medicine, 2021, 38(11): 1207-1213. doi:10.13213/j.cnki.jeom.2021.21085.